The dynamic research fields of biofabrication and tissue engineering (TE) play a pivotal role in bridging the translational gap between research and clinical applications. The advent of 3D printing technologies have prompted great advancements in these two research fields by enabling the fabrication of analogs mimicking the complex hierarchical organization of human tissues and organs. Key to this progress is the development of innovative hydrogels as they can be ideal scaffolding material considering their similarity to the extracellular matrix (ECM), processability under mild conditions, and usually a straightforward and minimally invasive translation into the human body. Hydrogels can be formed by chemical crosslinking using external stimuli (e.g., light) in a quick and controlled manner. In recent years, radical-mediated thiol-ene polymerizations have experienced an awakening of attention in the field of biofabrication and TE. Indeed, this crosslinking strategy yields to hydrogels characterized by lower shrinkage stress, homogenous networks with a low amount of unreacted monomer, along with a high resistance to oxygen inhibition. In this dissertation the focus is centered on developing and optimizing photosensitive biomaterial-based hydrogels tailored for thiol-ene click chemistry strategies, and subsequently integrating these advanced materials with cutting-edge 3D printing techniques. An innovative example of this integration is represented by the development of a novel optical fiber-assisted printing (OFAP) technology which aims to provide a valuable alternative in the field of vat photopolymerization (VPP) and exploit the fast thiol-ene click chemistry crosslinking strategy for both the straightforward 2D photopatterning and the embedded 3D printing of gelatin-based photosensitive precursors. All in all, the continuous evolution of these fabrication technologies along with the development of advanced cell-instructive biomaterials hold promise for transformative breakthroughs in biofabrication and TE. The first chapter of this dissertation contains a comprehensive state of the art about hydrogels in the context of biofabrication and TE, with up-to-date definitions of bioinks and their distinction from biomaterial inks. Moving towards light-based printing techniques, an important definition and contextualization of photopolymer resins and bioresins is given. Furthermore, an in-depth discussion around the state of the art of photosensitive hydrogels and their applications along with the novel light-based 3D printing techniques is highlighted. Eventually, the main goal of the thesis and the contribution of each chapter to the overarching goal are presented. While designing a functionalized biomaterial for TE applications, the possibility to tune its molecular properties, such as average molecular weight and degree of functionalization, represents an important aspect for establishing it as flexible platform towards different cells and tissues. The second chapter of this thesis focuses on the design of functional gelatin-based hydrogels with tuned degree of modification for supporting long-term survival and functionality of primary human fibroblast and endothelial cells. Gelatin, a well-established biomaterial, is modified with allyl moieties (gelAGE) and crosslinked via thiol-ene click chemistry in the presence of a polyethylene glycol (PEG)-based thiolated crosslinker and a photoinitiator. In this work, two gelAGE products, G1MM and G2LH, with different molecular properties
are developed. The G2LH-based biomaterial is characterized by longer and less functionalized gelatin chains compared to the G1MM-based analog. These properties are exploited to fabricate a hydrogel featuring a lower total polymer content, thus a lower crosslinking density. Indeed, the G2LH-based hydrogel is characterized by a softer polymer matrix with a homogeneous and open porosity. While the cell viability is comparable in both G1MM- and G2LH-based hydrogels, the latter demonstrates to better support F-acting organization and cell-cell interaction, leading to tubular-like structures in the co-culture samples. The supported cellular functionality from the G2LH-based hydrogel is eventually demonstrated by the secretion of ECM molecules as fibronectin and collagen. This study contributes to the thesis by establishing a tailored and functional biomaterial platform for TE, addressing the specific needs of human primary fibroblast and endothelial cells both in mono- and co-culture. Natural tissues often feature mechanical and functional gradients, thus mimicking these intricated structures with additive manufacturing (AM) approaches poses challenges that includes high spatiotemporal control and availability of versatile biomaterials inks. The third chapter introduces a novel composite biomaterial ink formulation for direct ink writing (DIW) specifically focusing on the fabrication of constructs featuring dual independent gradients. The hypothesis of this study is that the combination of multifunctional cellulose nanofibrils (CNFs), also featuring azido moieties, with a photosensitive gelAGE-based matrix would enable the introduction of independent mechanical and functional gradients. Initially, a precursor solution composed of succinylated nanocellulose (C6SA-CNF), gelAGE, linear di-thiolated PEG and a photoinitiator is used to create mechanical gradients. Two straightforward and alternative strategies, namely gradient and anisotropic printing, are used to achieve this goal. A key aspect for the introduction of functional gradients in the 3D printed analogs is the functionalization of C6SA-CNF with azido moieties (C6SA-CNF-N3). Indeed, these functional groups show the capability of undergoing spontaneous click chemistry with a water-soluble dye (DBCO-Cy5). Independent dual gradients are obtained by using a combination of gradient and anisotropic printing, and subsequently dipping the printed analog into a solution of DBCO-Cy5 to induce the spontaneous click reaction. This chapter explores the unique properties of multifunctional nanocellulose to fabricate independent dual gradients and further corroborate the versatility of gelAGE towards the design of composite biomaterial inks for DIW. The fourth chapter focuses on volumetric bioprinting (VBP), a fabrication technique which holds great potential due to its capability of generating complex cell-tissue constructs in tens of seconds with high-throughput, thus addressing one of the major limitations of established AM technologies. While VBP enables rapid fabrication of living tissue constructs, the challenge remains in developing compatible resins. Specifically, the need for soft hydrogels with suitable viscosity and optical transparency, aligning with the requirements of the technology, represents a significant research gap. The study further advances the technology by exploiting thiol-ene click chemistry to precisely control the hydrogel network architecture and match the fast-printing times of VBP, while maintaining exceptionally soft polymer matrices. This chapter significantly contributes to the thesis by modifying the gelAGE platform towards soft photoresins for VBP, enabling an environment suitable for adipose tissue engineering. In the fifth chapter of this dissertation, a novel and straightforward light-based 3D printing technology, OFAP, is presented as valuable alternative in the field of VPP. In this study, an innovative LED-coupled optical fiber is combined with an automated platform which control its spatiotemporal position for both 2D and 3D printing of photosensitive gelatin-based resins. OFAP demonstrates enhanced precision for 2D photopatterning through the on-the-fly adjustment of printing parameters as gap and light dosage, offering a versatile and reproducible platform for fabricating structures with progressive features and multi-material constructs, layer-by-layer. An optimized resin composition utilizing gelAGE with food dyes as light absorbers is introduced. Furthermore, a novel gelatin-based biomaterial featuring alkyne groups, exhibits absorption in near-visible light, aligning with OFAP requirements. Beyond 2D patterning, OFAP extends to embedded 3D printing within a resin bath, demonstrating potential towards the fabrication of biomimetic scaffolds and TE. The sixth chapter contains an exhaustive conclusive discussion about the findings of each chapter and their contribution to the final goal of the dissertation along with future perspectives.
Overall, this dissertation contains innovative approaches to harness the great potential of advanced cell instructive biomaterials and cutting-edge 3D printing techniques to contribute on the fast-paced evolution of biofabrication and TE. Particularly, a tunable and flexible gelatin-based biomaterial is presented to not only fabricate hydrogels suitable for specific tissue and cells, but also as universal biomaterial ink and bioresin platform adaptable for cutting-edge 3D printing techniques as DIW, OFAP and VBP. / Die dynamischen Forschungsbereiche der Biofabrikation und des Tissue Engineering (TE) spielen eine entscheidende Rolle bei der Überbrückung der Kluft zwischen Forschung und klinischen Anwendungen. Das Aufkommen von 3D-Drucktechnologien hat zu großen Fortschritten in diesen beiden Forschungsbereichen geführt, da sie die Herstellung von Analoga ermöglichen, die die komplexe hierarchische Organisation von menschlichem Gewebe und Organen nachahmen. Der Schlüssel zu diesem Fortschritt ist die Entwicklung innovativer Hydrogele, die aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit dem extrakutanen Gewebe und den Organen ein ideales Gerüstmaterial sein können aufgrund ihrer Ähnlichkeit mit der extrazellulären Matrix (ECM), ihrer Verarbeitbarkeit unter milden Bedingungen und ihrer in der Regel unkomplizierten und minimalinvasiven Anwendung im menschlichen Körper. Hydrogele können durch chemische Vernetzung unter Verwendung externer Reize (z. B. Licht) schnell und kontrolliert gebildet werden. In den letzten Jahren wurde die radikal-vermit- telte Thiol-En-Polymerisationen in den letzten Jahren auf dem Gebiet der Biofabrikation und der TE große Aufmerksamkeit erlangt. Diese Vernetzungsstrategie führt zu Hydrogelen, die sich durch eine geringere Schrumpfspannung, homogene Netzwerke mit einem geringen Anteil an nicht umgesetzten Monomeren und eine hohe Beständigkeit gegen Sauerstoffinhibition auszeichnen. In dieser Dissertation liegt der Schwerpunkt auf der Entwicklung und Optimierung lichtempfindlicher Hydrogele auf Biomaterialbasis, die für Thiol-En-Click-Chemie-Strategien maßgeschneidert sind, und der anschließenden Integration dieser fortschrittlichen Materialien in modernste 3D-Drucktechniken. Ein innovatives Beispiel für diese Integration ist die Entwicklung einer neuartigen faseroptischen Drucktechnologie (OFAP), die eine wertvolle Alternative im Bereich der Bottich- Photopolymerisation (VPP) darstellt und die schnelle Thiol-En-Click-Chemie-Ver- netzungsstrategie sowohl für die einfache 2D-Photostrukturierung als auch für den eingebetteten 3D-Druck von lichtempfindlichen Gelatine-basierten Vorläufern nutzt. Alles in allem verspricht die kontinuierliche Weiterentwicklung dieser Herstellungstechnologien zusammen mit der Entwicklung fortschrittlicher zellin- struktiver Biomaterialien transformative Durchbrüche in der Biofabrikation und TE. Das erste Kapitel dieser Dissertation enthält einen umfassenden Überblick über den Stand der Technik bei Hydrogelen im Zusammenhang mit Biofabrikation und TE, mit aktuellen Definitionen von Biotinten und deren Unterscheidung von Bio- materialtinten. Im Hinblick auf lichtbasierte Drucktechniken wird eine wichtige Definition und Kontextualisierung von Photopolymerharzen und Bioresinen gegeben. Darüber hinaus wird der aktuelle Stand der Technik bei lichtempfindlichen Hydrogelen und ihren Anwendungen sowie den neuartigen lichtbasierten 3D-Drucktechniken eingehend erörtert. Schließlich werden das Hauptziel der Arbeit und der Beitrag der einzelnen Kapitel zu diesem übergeordneten Ziel vorgestellt. Bei der Entwicklung eines funktionalisierten Biomaterials für TE-Anwendungen ist die Möglichkeit, seine molekularen Eigenschaften, wie z. B. das durchschnittliche Molekulargewicht und den Grad der Funktionalisierung, einzustellen, ein wichtiger Aspekt, um es als flexible Plattform für verschiedene Zellen und Gewebe zu etablieren. Das zweite Kapitel dieser Arbeit befasst sich mit der Entwicklung funktioneller Hydrogele auf Gelatinebasis mit abgestimmtem Modifizierungsgrad zur Unterstütz- ung des langfristigen Überlebens und der Funktionalität primärer menschlicher Fibroblasten und Endothelzellen. Gelatine, ein bewährtes Biomaterial, wird mit Allylgruppen (gelAGE) modifiziert und über Thiol-En-Click-Chemie in Gegenwart eines thiolierten Vernetzers auf Polyethylenglykol Basis (PEG) und eines Photoinitiators vernetzt. In dieser Arbeit werden zwei gelAGE-Produkte, G1MM und G2LH, mit unterschiedlichen molekularen Eigenschaften entwickelt. Das auf G2LH basierende Biomaterial zeichnet sich durch längere und weniger funktionalisierte Gelatineketten im Vergleich zum G1MM-basierten Analogon aus. Diese Eigenschaften werden ausgenutzt um ein Hydrogel herzustellen, das einen geringeren Gesamtpolymer- gehalt und damit eine geringere Vernetzungsdichte aufweist. Das Hydrogel auf G2LH-Basis zeichnet sich durch eine weichere Polymermatrix mit einer homogenen und offenen Porosität aus. Während die Lebensfähigkeit der Zellen sowohl in den G1MM- als auch in den G2LH-basierten Hydrogelen vergleichbar ist, zeigt sich, dass letztere eine bessere F-Organisation und Zell-Zell-Interaktion unterstützen, was zu röhrenartigen Strukturen in den Co-Kulturproben führt. Die durch das G2LH-Hy- drogel unterstützte zelluläre Funktionalität Hydrogels wird schließlich durch die Sekretion von ECM-Molekülen wie Fibronektin und Kollagen nachgewiesen. Diese
Studie leistet einen Beitrag zur Dissertation, indem sie eine maßgeschneiderte und funktionelle Biomaterialplattform für TE entwickelt, die den spezifischen Bedürfnissen von humanen primären Fibroblasten- und Endothelzellen sowohl in Mono- als auch in Co-Kultur gerecht wird. Natürliche Gewebe weisen häufig mechanische und funktionale Gradienten auf. Die Nachahmung dieser komplizierten Strukturen mit additiven Fertigungsverfahren (AM) stellt daher eine Herausforderung dar, zu der eine hohe räumliche und zeitliche Kontrolle und die Verfügbarkeit vielseitiger Biomaterialtinten gehören. Im dritten Kapitel wird eine neuartige Komposit-Biomaterialtintenformulierung für das Direct Ink Writing (DIW) vorgestellt, die speziell auf die Herstellung von Konstrukten mit zwei unabhängigen Gradienten ausgerichtet ist. Die Hypothese dieser Studie ist, dass die Kombination von multifunktionalen Cellulose-Nanofibrillen (CNFs), die auch Azidogruppen, mit einer lichtempfindlichen Matrix auf der Basis von gelAGE die Einführung unabhängiger mechanischer und funktioneller Gradienten ermöglichen würde. Zunächst wird eine Vorläuferlösung aus succinylierter Nanocellulose (C6SA-CNF), gelAGE, linearem di-thioliertem PEG und einem Photoinitiator verwendet, um mechanische Gradienten zu erzeugen. Zur Erreichung dieses Ziels werden zwei einfache und alternative Strategien, nämlich das Gradienten- und das anisotrope Drucken, eingesetzt. Ein Schlüsselaspekt für die Einführung funktioneller Gradienten in den 3D-gedruckten Analoga ist die Funktionalisierung von C6SA-CNF mit Azidogruppen (C6SA-CNF-N3). Diese funktionellen Gruppen sind in der Lage, eine spontane Klick-Chemie mit einem wasserlöslichen Farbstoff (DBCO-Cy5) einzugehen. Unabhängige duale Gradienten werden durch eine Kombination aus Gradienten- und anisotropem Druck und anschließendem Eintauchen des gedruckten Analogons in eine DBCO-Cy5-Lösung zur Auslösung der spontanen Click-Reaktion erzielt. In diesem Kapitel werden die einzigartigen Eigenschaften der multifunktiona- len Nanocellulose zur Herstellung unabhängiger dualer Gradienten erforscht und die Vielseitigkeit von gelAGE im Hinblick auf die Entwicklung von zusammengesetzten Biomaterialtinten für DIW weiter untermauert. Das vierte Kapitel befasst sich mit dem volumetrischen Bioprinting (VBP), einer Herstellungstechnik, die aufgrund ihrer Fähigkeit, komplexe Zell-Gewebe-Konstrukte in wenigen Sekunden und mit hohem Durchsatz zu erzeugen, ein großes Potenzial birgt und damit eine der größten Einschränkungen etablierter AM-Technologien überwindet. Während VBP die schnelle Herstellung von lebenden Gewebekonstrukten ermöglicht, besteht die Herausforderung in der Entwicklung kompatibler Harze. Insbesondere der Bedarf an weichen Hydrogelen mit geeigneter Viskosität und optischer Transparenz, die mit den Anforderungen der Technologie übereins- timmen, stellt eine erhebliche Forschungslücke dar. Die Studie bringt die Technologie weiter voran, indem sie die Thiol-En-Click-Chemie nutzt, um die Architektur des Hydrogel-Netzwerks präzise zu steuern und die schnellen Druckzeiten von VBP zu erreichen, während gleichzeitig außergewöhnlich weiche Polymermatrizen erhalten bleiben. Dieses Kapitel leistet einen wichtigen Beitrag zur Dissertation, indem es die gelAGE-Plattform in Richtung weiches Photoresin für VBP modifiziert und damit eine Umgebung ermöglicht, die für das Adipose Tissue Engineering geeignet ist. Im fünften Kapitel dieser Dissertation wird eine neuartige und unkomplizierte lichtbasierte 3D-Drucktechnologie, OFAP, als wertvolle Alternative im Bereich des VPP vorgestellt. In dieser Studie wird eine innovative LED-gekoppelte optische Faser mit einer automatisierten Plattform kombiniert, die ihre räumlich-zeitliche Position sowohl für den 2D- als auch den 3D-Druck von lichtempfindlichen gelatinebasierten Harzen kontrolliert. OFAP zeigt eine verbesserte Präzision für das 2D-Photomustering durch die fliegende Anpassung von Druckparametern wie Spalt und Lichtdosierung und bietet eine vielseitige und reproduzierbare Plattform für die Herstellung von Strukturen mit progressiven Merkmalen und Multi- materialkonstruktionen, Schicht für Schicht. Eine optimierte Harzzusammensetzung unter Verwendung von gelAGE mit Lebensmittelfarbstoffen als Lichtabsorber wird vorgestellt. Darüber hinaus zeigt ein neuartiges Biomaterial auf Gelatine- basis mit Alkin-Gruppen eine Absorption im nahen sichtbaren Bereich, was den OFAP-Anforderungen entspricht. Über die 2D-Musterung hinaus ermöglicht OFAP auch den eingebetteten 3D-Druck in einem Harzbad und zeigt damit das Potenzial für die Herstellung biomimetischer Gerüste und TE. Das sechste Kapitel enthält eine ausführliche abschließende Diskussion über die Ergebnisse der einzelnen Kapitel und ihren Beitrag zum Endziel der Dissertation sowie Zukunftsperspektiven. Insgesamt enthält diese Dissertation innovative Ansätze zur Nutzung des großen Potenzials fortschrittlicher zellinstruktiver Biomaterialien und modernster 3D-Drucktechniken, um zur rasanten Entwicklung der Biofabrikation und TE beizutragen. Insbesondere wird ein abstimmbares und flexibles Biomaterial auf Gelatinebasis vorgestellt, mit dem nicht nur Hydrogele hergestellt werden können, die für bestimmte Gewebe und Zellen geeignet sind, sondern das auch als universelle Biomaterialtinte und Bioresin-Plattform für modernste 3D-Druckverfahren wie DIW, OFAP und VBP geeignet ist.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:37585 |
| Date | January 2024 |
| Creators | Cianciosi, Alessandro |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | https://creativecommons.org/licenses/by-sa/4.0/deed.de, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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