In den vorliegenden Studien wurden verschiedene diagnostische Verfahren zum Nachweis von Protozoen und Nematoden im Hinblick auf Sensitivität, Arbeitsaufwand und Kosten miteinander verglichen. Zudem wurde die Eignung der PCR zur molekularen Charakterisierung der Cryptosporidium spp. exemplarisch an Igelkotproben getestet.
Bei der Untersuchung von 90 Ferkelkotproben auf I. suis war die Sensitivität eines Kotausstriches mit nachfolgender Autofluoreszenzmikroskopie (AM) signifikant höher als bei einem Flotationsverfahren (FV) mit NaCl-Zucker-Lösung und bei dem kombinierten Sedimentations-Flotations-Verfahren (KSFV) mit verschiedenen Flotationslösungen (NaCl, ZnSO4, NaCl-Zucker-Lösung) mit nachfolgender Lichtmikroskopie. Zudem ist der Arbeitsaufwand für die AM deutlich geringer als bei dem FV und KSFV. Die höheren apparativen Kosten für die AM sind bei hohem Probendurchsatz durch den geringeren Zeitaufwand und der höheren Sensitivität gerechtfertigt.
Die Anzahl Kryptosporidien-positiver Proben war bei der Untersuchung von 103 Kälberkotproben auf Cryptosporidium sp. mittels Enzymimmunoassays (EIA; ProSpecT® Cryptosporidium Microplate Assay) im Vergleich zur Karbolfuchsin-Färbung (CF) nach HEINE (1981) und der modifizierten-Ziehl-Neelsen-Färbung (MZN) nach HENRIKSEN u. POHLENZ (1982) am höchsten und signifikant höher als bei der Anwendung der MZN, wenn 10 Blickfelder durchmustert wurden. Bei der Untersuchung von 74 Igelkotproben auf Cryptosporidium sp. mittels EIA (ProSpecT®), einem immunochromatographischen Verfahren (FASTest® CRYPTO Strip), der MZN nach HENRIKSEN u. POHLENZ (1981) und einem direkten Immunfluoreszenz-Test (IFA; MERIFLUOR Cryptosporidium/Giardia) wurden in 9 (EIA), 10 (FASTest®), 11 (MZN) und 12 (IFA) Proben Cryptosporidium sp. nachgewiesen. Der Arbeitsaufwand des FASTest® und der CF ist mit dem EIA vergleichbar, während der IFA und die MZN mehr Zeit benötigen. Die Anwendung des FASTest®, des IFA und des EIA ist mit höheren Kosten verbunden als bei den Färbemethoden, können aber gut in den Arbeitsablauf eines diagnostischen Labors eingefügt werden und sind einfach auszuwerten.
Darüber hinaus wurden 45 Kotproben, welche bis zu 27 Tage bei verschiedenen Temperaturen (+6 °C, +16 °C, +30 °C, +40 °C) gelagert wurden, untersucht, um einen Einfluss der Temperatur auf das Untersuchungsergebnis von EIA, CF und MZN zu ermitteln. Während sich die Anzahl positiver Proben bei der Untersuchung mit den Färbemethoden temperatur- und zeitabhängig reduzierte, wurde das Untersuchungsergebnis mittels EIA von der Lagerungstemperatur nicht beeinflusst, so dass ungekühlt transportierte Proben vorzugsweise mit dem EIA untersucht werden sollten. Dagegen ist die CF aufgrund ihrer einfachen und preiswerten Durchführung zur Untersuchung einer hohen Anzahl an Proben geeignet, sofern eine ununterbrochene Kühlung der Proben gewährleistet ist und diese innerhalb von drei Tagen untersucht werden. Der FASTest® ist zur Anwendung in Tierarztpraxen und Ställen geeignet, da zur Untersuchung kein Mikroskop benötigt wird und die Resultate schnell vorliegen. Die Verwendung des IFA, der Kryptosporidien-Oozysten und Giardien-Zysten nachweist, bietet sich vor allem bei Proben an, die auf beide Protozoen untersucht werden sollen.
Das Vorkommen der Kryptosporidiose bei unterentwickelten und geschwächten Igeln, welche zum Überwintern in Igelstationen aufgenommen werden, ist hoch. Von 188 untersuchten Igelkotproben konnten in 29,8 % der Proben Cryptosporidium spp. nachgewiesen werden. Durch die Genotypisierung der Kryptosporidien aus 15 positiven Igelkotproben mittels RFLP-PCR basierend auf dem 18S rRNA-Gen konnte in allen untersuchten Proben die Präsenz von C. parvum gezeigt werden. Mit Hilfe der Multilocus-Sequenz-Typisierung der Fragmente des 60kDa Glycoprotein-Gens, des 18S rRNA-Gens, des Actin-Gens und des 70 kDa Hitzeschockprotein-Gens konnten drei verschiedene Subtypen-Familien (IIa, IIc und eine neue als VIIa vorgeschlagene Subtypen-Familie) erkannt werden. Die von den Igeln ausgeschiedenen Kryptosporidien-Oozysten mit zum Teil nachgewiesenem zoonotischen Potential (IIa Subtypen-Familie) könnten eine Infektionsquelle für den Menschen sein, aber auch ein antropozoonotisches Potential (IIc Subtypen-Familie) sollte in Betracht gezogen werden, so dass die Hygiene in den Igelstationen einen hohen Stellenwert einnehmen sollte.
Die Untersuchungsergebnisse zum Nachweis von Eimeria-Arten beim Kalb von 70 Sammelkotproben, hergestellt aus 10 Einzelkotproben (SKP10), bzw. von 30 Sammelkotproben, zusammengesetzt aus 5 Einzelkotproben (SKP5), wurden mit denen der zugehörigen Einzelkotproben (EKP) verglichen. Die Resultate der EKP (arithmetischer Mittelwert) und der zugehörigen SKP weisen mit den signifikant häufigeren Abweichungen im Bereich von bis zu 100 Oozysten pro Gramm Kot (OpG) eine geringe Differenz zwischen den beiden Verfahren auf. Durch den sicheren Nachweis von Eimeria-Oozysten bei einem erwarteten Oozystengehalt von nur 202 OpG (SKP10) und 122 OpG (SKP5) ist die Untersuchung von Kälbersammelkotproben, eine Methode mit geringem Arbeitsaufwand und geringen Untersuchungskosten, zum Nachweis einer klinischen oder subklinischen Kokzidiose geeignet.
Bei 51 Pferdekotproben wurde jeweils dreimal das kombinierte Sedimentations-Flotations-Verfahren (KSFV), wobei die Entnahme von verschiedenen Lokalisationen der Kotprobe (aus der Randregion, dem Inneren oder aus beiden Lokalisationen) erfolgte, und jeweils dreimal das KSFV mit vorheriger Homogenisierung einer größeren Kotmenge zum Nachweis von Nematodeneier durchgeführt. Eine Anhäufung der Strongyliden- und Ascarideneier in einem bestimmten Bereich der Proben konnte durch die Untersuchungen der verschiedenen Lokalisationen (á 10 g Kot) nicht nachgewiesen werden, so dass eine weitgehend homogene Verteilung dieser Nematodeneier in einer Pferdekotprobe wahrscheinlich ist. Zudem konnten die Untersuchungsergebnisse des KSFV, bei welchem 10 g Kot untersucht werden, durch die vorherige Homogenisierung einer größeren Probenmenge nicht verbessert werden. Zum Nachweis von Nematoden beim Pferd sollte dem Labor eine ausreichende Probenmenge (ca. 50 g) zugesandt werden. Die Homogenisierung einer größeren Probenmenge vor der Durchführung einer diagnostischen Methode, bei der Aliquote von mindestens 10 g Kot Verwendung finden, ist unnötig. / The studies presented were carried out to compare different diagnostic methods for detection of protozoa and nematodes regarding sensitivity, expenditure of human labour and costs. Besides, the ability of the PCR for the molecular characterization of the Cryptosporidium spp. was tested exemplarily in faecal samples of hegdehogs.
The examination of ninety faecal samples of suckling piglets showed a significantly higher sensitivity of faecal smears examined by autofluorescence microscopy (AM) compared to the flotation method (FV) using NaCl-sucrose solution and the combined sedimentation-flotation method (KSFV) using different flotation solutions (NaCl, ZnSO4, NaCl-sucrose) scanned by bright field microscopy. Moreover the expenditure of human labour by AM is considerably lower than FV and KSFV. The costs related to equipment for AM is justified in case of high sample throughput and by superior sensitivity.
The enzyme immunoassay (EIA; ProSpecT® Cryptosporidium Microplate Assay) was the most sensitive method for diagnosis of cryptosporidiosis in calves (n = 103) compared to the carbol fuchsin (CF; HEINE 1981) and modified Ziehl-Neelsen (MZN; HENRIKSEN a. POHLENZ 1982) staining techniques. The sensitivity of the EIA was significantly higher than the MZN, if ten fields of view were scanned. 74 faecal samples of hedgehogs were examined with the EIA (ProSpecT®), an immunochromatographic method (FASTest® CRYPTO Strip), the MZN (HENRIKSEN u. POHLENZ (1981)) and a direct immunofluorescent assay (IFA; MERIFLUOR Cryptosporidium/Giardia). Cryptosporidium sp. were detected in 9 (EIA), 10 (FASTest®), 11 (MZN) und 12 (IFA) faecal samples. The hands on time of the FASTest® and CF is comparable to EIA while the IFA and MZN are more time-consuming. The examination of the FASTest®, IFA and EIA is combined with higher costs than the staining techniques, but they can be integrated in the work flow of a routine diagnostic laboratory easily and evaluation is simple. Moreover 45 faecal samples stored up to 27 days at different temperature (+6 °C, +16 °C, +30 °C, +40 °C) were examined to evaluate the influence of temperature on the results of EIA, CF and MZN. While the number of the positive samples of stained smears decreased in a temperature and time-dependent manner, the results of the EIA were not influenced by sample storage at any temperature, so that samples transported without cooling should be examined preferably by EIA. Nevertheless the CF due to its simplicity and low costs is suited for scanning of a high number of samples, if they were cooled continuously and examined within three days. The FASTest® is qualified for use in veterinary practice and stables, because the examination requires no microscope and the results are obtained immediately. The IFA, which can detect Crypotsporidium oocysts as well as Giardia cysts, is suited especially for faecal samples suspected to contain both protozoa.
Cryptosporidial infections are very frequent in hedgehogs which are admitted for hibernation to hedgehog rehabilitation centres because of their insufficient body weight and weakness. Cryptosporidium spp. were detected in 29.8 % of 188 faecal samples of hedgehogs. The genotyping of Cryptosporidium spp. by PCR and RFLP-PCR based on the 18S ribosomal RNA gene were performed on 15 faecal samples of hedgehogs positive for Cryptosporidium spp. and suggested the presence of C. parvum in all samples. Multilocus sequence typing on partial 60 kDa glycoprotein gene, 18S rRNA gene, actine gene, 70 kDa heat shock protein gene sequences revealed 3 different subtype families: IIa, IIc and a new proposed as VIIa subtype family. Some of the Cryptosporidium oocysts excreted from hedgehogs are zoonotical (IIa subtype family) or anthropozoonotic(IIc subtype family). Thus hygienic measurements to avoid transmission are essential in hedgehog rehabilitation centres.
The results of examination of 70 pooled faecal samples originating from 10 calves (SKP10) and 30 pooled faecal samples originating from 5 calves (SKP5) for detection of Eimeria spp. were compared with the arithmetic means of opg (oocysts per gram of faeces) counts of the respective single 10 or 5 samples. A low difference between both methods of less than 100 opg was significantly more frequently observed than higher differences. Low values of 202 opg and 122 opg were reliably detected in SKP10 und SKP5, respectively, and thus examination of pooled faecal samples appears to be suitably sensitive and cost effective to detect clinical and subclinical coccidiosis in calves.
51 faecal samples of horses were examined three times by KSFV for nematode eggs by taking aliquots from different locations of the same faecal samples (from the margin, from inside and from both locations). Thereafter the KSFV with the homogenisation of a larger amount of faeces was also carried out three times. The examination of samples from the different locations (each 10 g of faeces) delivered no evidence for accumulation of nematode eggs (strongyles and Parascaris equorum) in the faeces and thus the distribution of the nematode eggs appears sufficiently homogeneous in faecal samples of horses. Homogenisation of a larger amount of faeces did not improve the results of coproscopy. For diagnostic purposes 50 g faeces per sample should be shipped to the laboratory. The homogenisation of a larger amount of faeces before using a diagnostic method is dispensable, if aliquots of 10 g faeces are examined.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa.de:bsz:15-qucosa-115538 |
| Date | 10 June 2013 |
| Creators | Kuhnert-Paul, Yvonne |
| Contributors | Universität Leipzig, Veterinärmedizinische Fakultät, Prof. Dr. Arwid Daugschies, Prof. Dr. Arwid Daugschies, PD Dr. Hubertus Hertzberg |
| Publisher | Universitätsbibliothek Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
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