In the last years, DNA arrays have attracted increasing attention among medical diagnosis and analytical chemists. The broad range of application that has been found for DNA arrays makes them an important analytical tool. DNA arrays are relevant for the diagnosis of genetic diseases, detection of infectious agents, study of genetic predisposition, development of a personalised medicine, detection of differential genetic expression, forensic science, drug screening, food safety and environmental monitoring.Despite the great promise of DNA arrays in health care and their success in medical and biological research, the technology is still far away from the daily use in the clinic and even more far away from their implementation in home-diagnosis such as glucose biosensors. Their principal problems are the high cost and difficulty of use, because it is required costly laboratory instruments and biology knowledge for the labelling of the DNA prior to the sample injection into the array.On the other hand, the requirements that a biosensor should include are to be easy-to use so that it do not need the previous label of the sample and the addition of reagents. It should give a sensitive response in short time, and it should also include cheap generic multi-analyte detection.The work carried out in this thesis describes new concepts of electrochemical biosensoric platforms based on oligonucleotides for detection of label-free DNA and protein, which include these requirements.Preliminary experiments of direct DNA electrochemical detection of labelled ssDNA were performed to establish a protocol of DNA immobilisation, hybridisation and detection colourimetrically and electrochemically. DNA real samples and multi-analite detection on an array developed by biocopatible photolithography were used.To avoid the analyte labelling to develop an easy to use and low cost device, a label-free electrochemical displacement of DNA sensor was described. The method of detection by displacement requires the pre-hybridisation of the capture probe immobilised on the electrode surface with a sub-optimum mutated oligonucleotide labelled with a redox molecule. Due to the higher affinity of the target that is fully complementary to the capture probe, the sub-optimum label can be displaced when the complementary target is introduced in the system. The decrease of the signal would verify the presence of the target and should be proportional to its concentration. Sub-optimum hybridisation displacement detection was demonstrated colourimetrically and electrochemically with a sub-optimum mutated oligonucleotide labelled with horseradish peroxidase (HRP), and a ferrocene sub-optimum mutated oligonucleotide was also detected electrochemically, which do not required the addition of reagents for its detection.Furthermore different strategies to develop an electrochemical oligonucleotide (aptamer) based sensor for reagentless and label-free protein detection was carried out. The most sensitive aptasensor achieved 30 fM of detection limit in just 5 minutes. / En els últims anys, els xips d'ADN han atret una atenció creixen en els camps de la diagnosis mèdica i la química analítica, degut a la seva portabilitat, sensibilitat, especificitat, ràpida resposta i l'ampli ventall d'aplicacions. Els xips d'ADN són rellevants per la diagnosis de malalties genètiques, detecció d'agents infecciosos, estudis de predisposició genètica, desenvolupament de medicina personalitzada, detecció d'expressió genètica diferencial, medicina forense, exploració de medicaments, seguretat alimentaria, defensa militar i monitorització mediambiental. Encara que els xips basats en oligonucleòtids per la detecció d'ADN i proteïnes siguin una gran promesa en medicina i recerca biològica, aquesta tecnologia es encara molt lluny del seu ús diari en el camp clínic i encara més lluny de poder ser comercialitzada per ús domèstic com ho han estat el biosensors de glucosa. Els seus principals problemes són el seu alt cost i la seva dificultat d'ús. Ja que per la seva utilització és necessari, previ a la injecció de l'analit en el biosensor, costosos instruments de laboratori i tècnics especialitzats en bioquímica pel marcatge i amplificació de les mostres d'ADN. En canvi els requeriments que un biosensor ha d'incloure són, ser fàcil d'utilitzar, per tant que l'analit no necessiti un marcatge previ i l'addició de reactius per la seva detecció. Aquest ha de donar una resposta ràpida i sensible a baix cost i ha de permetre la detecció en el mateix equip de diferent tipus d'analits.El treball fet en aquesta tesis descriu el desenvolupament de nous concepte de plataformes biosensòriques electroquímiques basades en oligonucleòtids per la detecció d'ADN i proteïnes no marcades prèviament, els quals inclouen aquest requeriments. Experiments preliminars per la detecció de l'hibridació d'ADN marcat es van portar a fi per tal d'establir un protocol per la immobilització, hibridació i detecció d'ADN colorimètricament i electroquímicament. És van utilitzar mostres reals d'ADN i sistemes de detecció de multi-analits en un xip desenvolupat per fotolitografia biocompatible.Per tal de no necessitar un marcatge previ de la mostres d'ADN i així simplificar i reduir el cost del futur biosensor es va desenvolupar un sistema electroquímic de desplaçament. El mètode lliure de marcatge es basa en el desplaçament de molècules d'oligonucleòtid mutat i marcat, els quals encara que continguin certes mutacions són capaços d'hibridar amb la sonda d'oligonucleòtid immobilitzat, però quan aquestes es troben en presència de l'analit desplaça la molècula mutada i marcada, disminuint així la senyal de manera proporcional en la concentració del analit. El sistema de desplaçament ha estat demostrat colorimètricament i electroquímicament utilitzant un marcatge d'HRP sobre el mutat i utilitzant un marcatge de ferrocè en l'oligonucleòtid mutat per tal de no necessitar afegir cap reactiu per la detecció de l'analit, També es van portar a fi diferents estratègies per desenvolupar un biosensor electroquímic basat en oligonucleòtids (aptamers) per la detecció de la proteïna trombina sense el previ marcatge d'aquest analit i sense necessitat d'afegir reactius per la detecció del analit. En el sistema mes sensible es va obtenir un límit de detecció de 30 fM en un temps de resposta de sols 5 minuts. / En los últimos años, los chips de ADN han atraído una atención creciente diferentes campos, debido a su portabilidad, sensibilidad, especificidad y rápida respuesta. Los chips de ADN son aplicados en diagnosis de enfermedades genéticas, detección de agentes infecciosos, estudios de predisposición genética, desarrollo de medicina personalizada, detección de expresión genética diferencial, medicina forense, exploración de medicamentos, columnas de separación, seguridad alimentaría, defensa militar y monitorización medioambiental. Aunque los chips basados en oligonucleótidos para la detección de ADN y proteínas tienen un gran futuro en diagnosis e investigación biológica, esta tecnología está aun muy lejos de su uso diario en el campo clínico y aun mas lejos de poder ser comercializado para uso doméstico como lo han sido los biosensores de glucosa. Sus principales problemas son su alto coste y su dificultad de uso. Para su utilización es necesario, previo a la inyección del analito en el biosensor, costosos instrumentos de laboratorio y técnicos especializados en bioquímica para el marcaje y amplificación de las muestras de ADN. En cambio los requerimientos que un biosensor ha de incluir son, ser fácil de utilizar, por tanto el analito no ha de necesitar un marcaje previo ni la adición de reactivos para su detección. Este ha de dar una respuesta rápida y sensible a bajo coste y ha de permitir la detección en el mismo equipo de diferentes analitos.El trabajo hecho en esta tesis describe el desarrollo de nuevos conceptos de plataformas biosensóricas electroquímicas basadas en oligonucleótidos para la detección de ADN y proteínas no marcadas previamente, los cuales incluyen estos requerimientos.Experimentos preliminares para la detección directa de la hibridación de ADN marcado se llevó a cabo para establecer protocolos para la inmovilización, hibridación y detección de ADN colorimétricamente y electroquímicamente. Se utilizaron muestras reales y sistemas de detección de multi-analitos en un chip desarrollado por fotolitografía biocompatible.Para no necesitar un marcaje previo de la muestra de ADN y así simplificar y reducir el coste del futuro biosensor se desarrolló un sistema electroquímico de desplazamiento. El método libre de marcaje se basa en el desplazamiento de moléculas de oligonucleótido mutado y marcado, el cual aunque contenga ciertas mutaciones es capaz de hibridar con la sonda de oligonucleótido inmovilizado, pero cuando estas se encuentran en presencia del analito desplaza la molécula mutada, disminuyendo así la señal de manera proporcional a la concentración del analito. El sistema de desplazamiento ha sido demostrado colorimétricamente y electroquímicamente utilizando marcaje de HRP sobre el mutado, así como un marcaje de ferroceno que no requiere la adición de reactivos para su detección. También se llevaron a cabo diferentes estrategias para desarrollar un biosensor electroquímico basado en oligonucleótidos (aptámeros) para la detección de trombina sin el previo marcaje de este analito, ni la adición de reactivos para la detección del analito. En el sistema más sensible se obtuvo un límite de detección de 30 fM en un tiempo de respuesta de solo 5 minutos
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_URV/oai:www.tdx.cat:10803/8542 |
| Date | 24 November 2006 |
| Creators | Mir Llorente, Mònica |
| Contributors | Katakis, Ioanis, Universitat Rovira i Virgili. Departament d'Enginyeria Química |
| Publisher | Universitat Rovira i Virgili |
| Source Sets | Universitat Rovira i Virgili |
| Language | English |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.0066 seconds