O câncer colorretal é uma das malignidades com maior incidência no Brasil e, na maioria dos casos, tem poucos sintomas visíveis até a doença estar em um estágio avançado. Pensando em simplificar o procedimento do exame e fazer um diagnóstico mais rápido para pacientes com câncer colorretal, este estudo teve como objetivo desenvolver um processo de diagnóstico simplificado baseado na caracterização de um biossensor eletroquímico em que fitas simples de miRNAs de interesse foram imobilizadas na superfície de eletrodos de ouro com objetivo de fazer a detecção de sua fita complementar utilizando-se dos métodos de espectroscopia de impedância eletroquímica e microbalança de cristal de quartzo. A sequência que foi imobilizada foi uma sequência de DNA que corresponde ao miRNA-224, cuja elevada expressão foi recentemente correlacionada com a agressividade e a incidência de metástase em pacientes com câncer colorretal. Os dados obtidos através da técnica de EIS foram comparados a dois modelos físicos de circuito equivalente, o circuito Randles clássico e um circuito Randles modificado, onde o capacitor foi substituído por um elemento de fase constante, tentando modelar de maneira mais eficiente a dupla camada que se forma na região de contado do eletrodo com a solução eletrolítica. O modelo modificado apresentou uma janela de funcionamento de 40,11% enquanto o circuito original apresentou uma janela de funcionamento de 23,98%; o que juntamente com o embasamento teórico do modelo de dupla camada fez com que o circuito modificado tenha sido escolhido para modelar os dados dos experimentos feitos na sequência. Tendo em vista que a imobilização das fitas simples de DNA na superfície do eletrodo de ouro é o passo chave para a obtenção de uma resposta satisfatória no biossensor, foram feitos testes alterando a proporção de DNA e espaçadores na fase de funcionalização a fim de determinar qual a proporção que otimiza a resposta do sensor. Comparando os resultados obtidos para as proporções de ssDNA:tiol total na etapa de funcionalização do eletrodo de 1:3, 1:4 e 1:5, a proporção 1:4 que corresponde a 20% de amostra no buffer de imobilização foi a que levou a uma maior variação percentual dos valores de Rct devido às hibridizações. Considerando esses como sendo os parâmetros otimizados para o sistema, foi construída então uma curva de caracterização do sensor, e o limite de detecção encontrado foi de 10pM; um valor considerado alto comparado com outros experimentos semelhantes, entretanto deve-se lembrar que o sistema aqui estudado não fez o uso de elementos amplificadores, como nanopartículas ou intercaladores de DNA. Para fins de comparação entre técnicas, foi conduzida uma análise semelhante utilizando uma microbalança de cristal de quartzo. Inicialmente foram utilizados os parâmetros encontrados como otimizados para a EIS, e posteriormente foram usados parâmetros mais próximos aos otimizados para essa técnica encontrados na literatura. Em ambos os casos foi possível observar variações referentes à hibridização das fitas complementares, entretanto como esperado, a resposta se mostrou mais expressiva para o segundo caso. Essas diferenças de resposta puderam ser relacionadas aos diferentes princípios de funcionamento dos sensores nas duas técnicas, mostrando que para a QCM o fator que influencia na resposta está relacionado à quantidade total de amostra imobilizada na superfície do eletrodo, enquanto que para a técnica de EIS o mais relevante é o quão compacta a camada se mostra. / Colorectal cancer is one of the most prevalent malignancies in Brazil and, in most cases, has few visible symptoms until the disease is at an advanced stage. In order to simplify the examination procedure and to make a faster diagnosis for patients with colorectal cancer, this study aimed to develop a simplified diagnostic process based on the characterization of an electrochemical biosensor in which single strands of miRNAs of interest were immobilized on the surface of gold electrodes with the objective of detecting their complementary strand using the methods of electrochemical impedance spectroscopy and quartz crystal microbalance. The sequence that was immobilized was a DNA sequence corresponding to miRNA-224, whose high expression was recently correlated with the aggressiveness and incidence of metastasis in patients with colorectal cancer. The data obtained through the EIS technique were compared to two equivalent circuit models, the classic Randles circuit and a modified Randles circuit, where the capacitor was replaced by a constant phase element, trying to more efficiently model the double layer that is formed in the interface between the electrode and the electrolytic solution. The modified model presented an operating range of 40.11% while the original circuit presented an operating range of 23.98%; which along with the theoretical understanding of the double-layer model made the modified circuit to be chosen as the model to fit the data of the experiments realized in the sequence. Considering that the immobilization of the simple DNA strands on the surface of the gold electrode is the key step to obtain a satisfactory response in the biosensor, tests were performed by altering the ratio of DNA and spacers in the functionalization phase in order to determine which the ratio that optimizes the sensor response. Comparing the results obtained for the proportions of ssDNA:total thiol in the functionalization stage of the electrode of 1:3, 1:4 and 1:5, the ratio 1:4 corresponding to 20% of sample in the immobilization buffer was the one that led to a greater percentage variation of Rct values due to hybridizations. Considering these as the optimized parameters for the system, a sensor characterization curve was built, and the limit of detection found was 10pM; a value considered high compared to other similar experiments, however it must be remembered that the system studied here did not make use of amplifying elements, such as nanoparticles or DNA intercalators. For purposes of comparing techniques, a similar analysis was conducted using a quartz crystal microbalance. Initially, the parameters found as optimized for the SIS were used, and later parameters that were closer to those optimized for this technique found in the literature were. In both cases it was possible to observe variations related to the hybridization of the complementary tapes, however, as expected, the response was more expressive for the second case. These differences in optimization parameters for the two techniques could be related to the different principles of sensor operation, showing that for the QCM the factor that influences the response is related to the total amount of sample immobilized on the surface of the electrode, while for the EIS technique the most relevant parameter is how compact the layer is.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-18022019-105254 |
| Date | 24 May 2018 |
| Creators | Dellevedove, Stephanie Lisboa |
| Contributors | Mulato, Marcelo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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