Le gène de l’entérotoxine thermostable b (estB) d’Escherichia coli a été
fusionné au gène de la protéine liant le maltose (malE) dans le vecteur
pMAL-p via PCR. Par la suite, deux constructions plasmidiques ont été
realisées à partir de ce nouveau vecteur, nommé pMAL-STb. Dans un premier
temps, un marqueur hexahistidine (His6) a été ajouté entre malE et estB, et
dans un deuxième temps, un marqueur décahistidine (His10) a été placé en
amont de malE. La séquence signal de la protéine liant le maltose (MBP)
dirige l’exportation de la protéine de fusion du cytoplasme vers le périplasme,
où l’entérotoxine STb acquière sa conformation active. MBP est également
reconnue pour améliorer le rendement et la solubilité de la protéine passagère
tandis que le marqueur histidine, connu comme étant le meilleur marqueur
d’affinité pour la purification protéique, facilite sa purification jusqu’à
homogénéité. De plus, les gènes fusionnés sont sous le contrôle du promoteur
tac (Ptac), un promoteur fort et inductible. Suite à l’induction par l’IPTG, la
souche recombinante exprime une protéine d’environ 48 kDa, qui est
facilement identifiable par électrophorèse à partir du surnageant obtenu via
choc osmotique. Une séquence encodant un site de clivage spécifique au
facteur Xa est présente dans le plasmide afin de séparer les marqueurs MBP et
histidine de STb. Le clivage de la protéine de fusion avec le facteur Xa libère
MBP (42 kDa) attachée au marqueur histidine et un polypeptide de 5.2 kDa,
correspondant au poids moléculaire de STb mature. Avec cette méthode, nous
visons à obtenir une méthode plus efficace pour la production et la
purification de STb. / The heat-stable enterotoxin b gene (estB) of Escherichia coli was fused
to the gene for maltose-binding protein (malE) into the pMAL-p vector using
PCR. Afterward, two plasmid constructs were realized from this new vector,
named pMAL-STb. Firstly, a hexahistidine tag (His6) was added between
malE and estB and secondly, a decahistidine tag (His10) was placed upstream
of malE. The signal sequence of maltose-binding protein (MBP) directs the
export of the fusion protein from the cytoplasm to the periplasm, where the
enterotoxin STb acquires its active conformation. MBP is also known to
improve the yield and solubility of the passenger protein while the histidine
tag, viewed as the best affinity tag for protein purification, facilitates its
purification to homogeneity. Furthermore, the fused genes are controlled by
the tac promoter (Ptac), a strong inducible promoter. Following IPTG
induction, the recombinant strain expressed a protein of approximately 48
kDa, which is easily identified from osmotic shock fluid following
electrophoresis. A sequence encoding a factor Xa cleavage site is present in
the plasmid to separate MBP and histidine tags from STb. The cleavage of the
fusion protein with factor Xa generates the maltose-binding protein (42 kDa)
attached to the histidine tag and a polypeptide of 5.2 kDa, corresponding to
the molecular mass of mature STb. With this method, we aim at obtaining a
more efficient way to produce and purify STb.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:umontreal.ca/oai:papyrus.bib.umontreal.ca:1866/18649 |
| Date | 08 1900 |
| Creators | Kerhoas, Maud |
| Contributors | Dubreuil, Daniel |
| Source Sets | Université de Montréal |
| Language | French |
| Detected Language | French |
| Type | Thèse ou Mémoire numérique / Electronic Thesis or Dissertation |
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