Magíster en Bioquímica área de Especialización en Bioquímica de Proteínas y Biotecnología / Memoria para optar al Título de Bioquímico / El género Salmonella agrupa a más de 2500 serovares, muchos de los cuales son patógenos humanos y animales. El serovar Dublin afecta principalmente al ganado bovino pudiendo llegar a infectar a seres humanos por el consumo de alimentos contaminados.
Salmonella presenta diversos mecanismos que le permiten ingresar y colonizar sistémicamente a sus hospederos. Algunos de estos mecanismos se relacionan con la capacidad de invadir el epitelio intestinal y sobrevivir al interior de las células del sistema inmune del hospedero, principalmente macrófagos. En ambos procesos los sistemas de secreción de proteínas juegan un papel fundamental.
El Sistema de Secreción Tipo VI (T6SS) es el sistema de secreción más recientemente descrito en bacterias Gram negativo. Este sistema se encuentra codificado en el genoma de cerca del 25% de las bacterias secuenciadas y su importancia en las relaciones interbacterianas y en la relación bacteria-hospedero lo han convertido en un blanco de estudio de gran interés. Previamente, hemos identificado la presencia de 5 T6SS filogenéticamente distintos y distribuidos diferencialmente en representantes del género Salmonella. S. Dublin posee dos T6SS codificados en las islas de patogenicidad SPI-6 y SPI-19.
El objetivo de este proyecto fue determinar si los T6SS codificados en SPI-6 y SPI-19 se expresan al interior de macrófagos murinos y si cumplen un papel en los procesos de invasión y supervivencia intracelular de S. Dublin en estas células. Para esto, se evaluó la expresión intracelular y translocación de un componente fundamental del sistema (VgrG) y se compararon mutantes de los T6SS de SPI-6 y SPI-19 respecto a la cepa silvestre en su capacidad de invadir y sobrevivir en macrófagos murinos en cultivo in vitro.
Para evaluar la expresión del gen vgrG y de la proteína VgrG codificada en cada uno de los T6SS presentes en el genoma de S. Dublin al interior de macrófagos, se construyeron en el cromosoma de la bacteria fusiones transcripcionales y traduccionales a la proteína fluorescente verde y se infectaron macrófagos RAW 264.7 con las cepas que contenían estas fusiones. Mediante microscopía de epifluorescencia se observó la expresión de las fusiones transcripcionales y traduccionales del componente VgrG de ambos T6SS desde tiempos tempranos de infección.
Para determinar la translocación de VgrG al citoplasma de macrófagos infectados in vitro, se utilizaron fusiones traduccionales de VgrGSPI-6 y VgrGSPI-19 al reportero TEM-1 construidas en el plasmidio pFlagTEM. La translocación de cada proteína de fusión se determinó mediante un ensayo de fluorescencia acoplado a FRET. Para ello, se infectaron macrófagos RAW 264.7 con las cepas que contenían estas fusiones y posteriormente se analizaron los macrófagos infectados mediante microscopía de epifluorescencia. Se observó la translocación de VgrGSPI-19 a tiempos tempranos de infección y la translocación de VgrGSPI-6 a tiempos tardíos de infección. Sin embargo, la baja frecuencia de los eventos de translocación observados hace necesario realizar la comprobación del fenómeno mediante metodologías más sensibles.
Para determinar si los T6SS codificados en el genoma de S. Dublin participan en los procesos de internalización y supervivencia de la bacteria al interior de macrófagos murinos, se realizaron ensayos de protección a gentamicina. En ellos se comparó la capacidad de ingresar y sobrevivir al interior de macrófagos RAW 264.7 de la cepa silvestre y cepas mutantes de los T6SS o del componente ClpV. Los resultados obtenidos en este trabajo demostraron que ninguno de los T6SS contribuye a la invasión y supervivencia intracelular de S. Dublin en macrófagos murinos.
En conclusión, los T6SS codificados en las islas de patogenicidad SPI-6 y SPI-19 de S. Dublin se expresan al interior de macrófagos murinos, pero no participan en la capacidad de la bacteria para invadir y sobrevivir al interior de éstos. / The Salmonella genus includes over 2500 serovars, many of which are human and animal pathogens. Although the serovar Dublin affects mainly livestock, it constitutes a threat to humans who consume contaminated foods.
Salmonella has several mechanisms to colonize its hosts systemically. These mechanisms allow it to invade the intestinal epithelium and survive within immune cells, mainly macrophages. Of note, protein secretion systems play a central role in these processes.
The Type VI Secretion System (T6SS) is the most recently described protein secretion system in Gram-negative bacteria. This secretion system is present in about 25% of all bacterial genomes and its putative role in inter-bacteria and bacteria-host relationships makes it an important target for scientific research. Previously we have identified the presence of 5 phylogenetically diverse T6SS distributed differentially in the Salmonella genus. S. Dublin carries two of these systems codified in the pathogenicity islands SPI-6 and SPI-19.
The aim of this thesis was to determine if the T6SSs codified in SPI-6 and SPI-19 are expressed in and translocated to the cytosol of murine macrophages, and if they play a role in the internalization and survival of S. Dublin inside these cells. To achieve this, intracellular expression and translocation of a core component of T6SSs (VgrG) was analyzed and T6SS mutants were compared with the parental strain in their ability to invade and survive within murine macrophages in vitro.
To asses the expression of the vgrG gene and VgrG protein codified in each S. Dublin T6SS within murine macrophages, transcriptional and translational fusions to the green fluorescent protein were constructed and macrophages RAW 264.7 were infected using the strains bearing these fusions. Using epifluorescence microscopy, expression was observed for the transcriptional and translational fusions of the VgrG component of both T6SSs. To determine the translocation of VgrG to the cytosol of infected macrophages in vitro, translational fusions of VgrGSPI-6 and VgrGSPI-19 to the TEM-1 reporter were constructed in plasmid pFlagTEM. Translocation of each protein was determined using a FRET-coupled fluorescence assay. To achieve this, RAW 264.7 macrophages were infected using strains bearing these fusions and subsequent analysis of the infected macrophages was carried out by epifluorescence microscopy. VgrGSPI-19 translocation was observed shortly after infection and VgrGSPI-6 translocation was observed several hours after infection. Noteworthy, due to the low frequency of the translocation events observed it is necessary to confirm this observation by means of more sensitive methods.
To determine if the T6SSs codified in the S. Dublin genome play a role in the internalization and survival processes of the bacteria within murine macrophages, gentamicin protection assays where conducted. In these experiments, the ability to enter and survive in RAW 264.7 macrophages in vitro was compared between T6SS and ClpV mutant strains and the parental strain. The results of this work show that none of the T6SSs contribute to the ability of S. Dublin to invade and survive in murine macrophages.
In conclusion, the T6SS encoded in pathogenicity islands SPI-6 and SPI-19 of S. Dublin are expressed in murine macrophages, but these do not play a role in the invasion or intracellular survival of the bacteria in these cells. / Fondecyt
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/113492 |
| Date | 10 1900 |
| Creators | Pinto Anwandter, Bernardo Ismael |
| Contributors | Contreras Osorio, Lucía Inés, Santiviago Cid, Carlos, Facultad de Ciencias Químicas y Farmacéuticas |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
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