Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa e Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. / Submitted by Oliveira Flávia (flavia@sisbin.ufop.br) on 2015-10-14T20:14:07Z
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Previous issue date: 2014 / A doença de Chagas, causada pelo protozoário Trypanosoma cruzi, é responsável por uma significante mortalidade e morbidade nas Américas Central e do Sul, afetando um número significativo da população mundial. A doença desenvolveu-se ao longo de décadas e a presença de mediadores inflamatórios e a hipertrofia cardíaca são características comuns. Buscando uma compreensão dos mecanismos moleculares que ocorrem no processo inflamatório e que subsidiem a caracterização de marcadores moleculares na patologia chagásica, a proteína COX-2 tornou se objeto de estudo. Sabe- se que a regulação desta proteína pode se dar a nível transcricional e/ou pós traducional, envolvendo um conjunto de fatores protéicos e incluindo a participação de miRNAs. Estudos recentes tem mostrado uma possível co-regulação indireta entre os níveis de PTEN e de COX-2, mas até o momento, os resultados preliminares ainda não elucidaram esses mecanismos. Particularmente, em relação à Doença de Chagas, poucos são os estudos que focam na elucidação do processamento do mRNAs na doença e nos fatores que co-regulam a proteína COX-2. Sendo assim, objetivou se nesse estudo analisar os moduladores do processo pró-inflamatório/ hipertrófico em células H9c2 infectadas pela cepa Berenice-62 do T.cruzi, buscando a caracterização de marcadores moleculares do processo inicial da Doença de Chagas. Para isso, os tempos de infecção de 0, 2, 6, 12, 24 e 48 horas foram estudados, logo após 2 horas de interação com o parasito. A comprovação da infectividade foi feita por ensaios de microscopia pela coloração com Giemsa e Dapi. A análise transcricional de genes correlatos ao processo inflamatório/ hipertrófico e de microRNAs foram realizados por ensaios de qRT-PCRs e as análises das proteínas COX-2, PTEN, P-PTEN foram investigadas nos ensaios de Western blots. Outros ensaios bioquímicos, como o de viabilidade celular e o de mensuração de prostaglandina E2, foram realizados. Com os resultados, conclui-se que a infecção com a cepa Be-62 diminui a viabilidade celular após 48 horas de infecção e modula os níveis de expressão dos marcadores de hipertrofia cardíaca Anf, Bnp e β –myhc, além de modular o ambiente pró-inflamatório nos intervalos iniciais de infecção, considerando-se o aumento da expressão e da atividade da proteína COX-2 e no aumento na produção de PGE2. Os resultados também demonstraram uma relação entre os genes Cox-2, Pten, Akt, sugerindo uma possível correlação cruzada entre COX-2 e PTEN. Os microRNAs-26b, -463,-1 e -21, respectivamente, indicaram uma possível regulação pós-traducional das proteínas COX-2 e PTEN, demonstrando um papel fundamental na instalação do quadro de hipertrofia. Estudos futuros poderão validar o papel dessas moléculas como marcadores moleculares e espera-se que os resultados do presente estudo possam direcionar a caracterização de moléculas que auxiliem no prognóstico e tratamento da doença de maneira direcionada, considerando-se a grande variabilidade genética das cepas do T. cruzi. ____________________________________________________________________________________________ / ABSTRACT: The Chagas disease, caused by the protozoan Trypanosoma cruzi, is responsible for significant mortality and morbidity in Central and South America, affecting a significant number of the world population. The disease develops over decades and the presence of inflammatory mediators and cardiac hypertrophy are common features. Searching for an understanding of the molecular mechanisms that occur during the inflammatory process, and that subsidize the characterization of molecular markers in Chagas disease, COX - 2 protein became an object of study. It is known that the regulation of this protein can occur at transcriptional and/ or post- translational level, involving a number of protein factors and including the involvement of miRNAs. Recent studies have shown a possible indirect co-regulation in the levels of PTEN and COX - 2, but so far the preliminary results not yet elucidated these mechanisms. Particularly in relation to Chagas disease, there are few studies that focus on the elucidation of the processing of mRNAs in this disease and in the factors that co - regulate COX - 2 protein. Therefore, this study was aimed to analyze the hypertrophic/ proinflammatory process modulators in H9c2 cells infected with strain Berenice -62 of the Trypanosoma cruzi, searching for characterize the molecular markers of the initial process of Chagas disease. For this reason, the time of infection of 0, 2, 6, 12, 24 and 48 hours were studied soon after 2 hours from the interaction with the parasite. The proof of the infectivity was performed by microscopy assays by the staining with Giemsa and Dapi. The transcriptional analysis of genes related to the inflammatory / hypertrophic process and microRNAs were performed by qRT- PCR assays and the analyzes of COX-2, PTEN, PTEN - P proteins were explored in Western blots assays. Other biochemical assays such as cell viability and measurement of prostaglandin E2 were performed. From the results, it is concluded that infection with Be- 62 strain decreases cell viability after 48 hours of infection and modulates the levels of expression of markers of cardiac hypertrophy Anf and Bnp β - myhc, in addition to modulate the environment pro-inflammatory in the initial intervals of infections, considering the increased expression and COX -2 protein activity and in the increased production of PGE2. The results also demonstrated a relationship among cox-2, pten, akt genes suggesting a possible cross- correlation between COX-2 and PTEN. MicroRNAs-26b, - 463, -21 and -1 respectively indicate a possible posttranslational regulation of COX-2 and PTEN protein, demonstrating a crucial role in the installation of hypertrophy. Future studies could validate the role of these molecules as molecular markers and it is expected that the results of this study may direct the characterization of molecules that assist in the prognosis and treatment of disease in targeted way, considering the high genetic variability of strains of T. cruzi.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:123456789/5708 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Mota, Suianne Letícia Antunes |
| Contributors | Moraes, Karen Cristiane Martinez de |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFOP, instname:Universidade Federal de Ouro Preto, instacron:UFOP |
| Rights | Autorização concedida ao Repositório Institucional da UFOP pelo autor, 03/07/2014, com as seguintes condições: disponível sob Licença Creative Commons 4.0, que permite copiar, distribuir e transmitir o trabalho, desde que seja citado o autor e licenciante. Não permite o uso para fins comerciais nem a adaptação desta., info:eu-repo/semantics/openAccess |
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