A tuberculose (TB) é uma das maiores causas de morte por infecção no mundo, sendo que, em 2015, registraram-se 10,4 milhões de novos casos. O agente etiológico da doença, o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), apresenta altos níveis de resistência frente aos quimioterápicos disponíveis para o tratamento da TB. Além disso, a terapia atual da doença explora poucos alvos essenciais ao Mtb. Neste sentido, explorar novos alvos, essenciais ao crescimento e sobrevivência da micobactéria é de grande interesse e poderia gerar fármacos mais efetivos, eficazes contra cepas resistentes e a forma latente da TB. Para este fim, o presente trabalho propôs o desenvolvimento de inibidores da enzima fosfopanteteína adenililtransferase (PPAT), a qual possui caráter regulatório na via de biossíntese da Coenzima A (CoA) da micobactéria. Inicialmente, propuseram-se 50 estruturas de potenciais inibidores da PPAT de M. tuberculosis (MtPPAT), baseando-se na estrutura de seu substrato, a fosfopanteteína, e na estrutura do sítio ativo da enzima. Em seguida, propuseram-se outros 28 ligantes. A fim de se prever as potenciais complementaridades entre os 78 inibidores propostos e o sítio ativo da MtPPAT, empregou-se a estratégia de docking. Posteriormente, realizaram-se cálculos semi-empíricos, com os complexos dos ligantes que se mostraram mais interessantes nas simulações de docking, a fim de se obter informações sobre a entalpia de interação dos ligantes com o sítio ativo da MtPPAT. A partir dos resultados obtidos nos estudos computacionais, selecionaram-se os inibidores que se mostraram mais promissores. A síntese destes ligantes e a de seus fragmentos foi realizada. Avaliaram-se a atividade microbiológica in vitro, bem como a citotoxicidade dos ligantes sintetizados. Alguns dos compostos sintetizados apresentaram atividade frente às cepas sensíveis e resistentes do Mtb na casa de micromolar. Todos os compostos ativos não foram considerados citotóxicos. A fim de validar o planejamento e o alvo dos possíveis inibidores, verificando a atividade inibitória desses frente à enzima MtPPAT, realizou-se a produção e purificação da enzima. Por fim, realizaram-se ensaios de inibição enzimática frente à MtPPAT, os quais permitiram a identificação dos primeiros inibidores da enzima já descritos, com atividade na casa de micromolar, validando-se o alvo em questão. / Tuberculosis is one of the major causes of death by infection worldwide. In 2015, 10.4 thousand new cases of the disease were registered. The tuberculosis\' causing agent Mycobacterium tuberculosis presents high levels of resistance for the available chemotherapy. Thereof, exploit new M. tuberculosis targets is of utmost importance to overcome drug resistant tuberculosis. In this sense, the enzyme phosphopantetheine adenylyltransferase (PPAT) generates scientific interest since it displays a regulatory role in the M. tuberculosis coenzyme A (CoA) biosynthesis. Therefore, the purpose of the present study was the development of M. tuberculosis PPAT (MtPPAT) inhibitors. Initially, 50 potentially MtPPAT inhibitors were designed based on MtPPAT\'s substrate and the enzyme\'s active site. After preliminary results, more 28 compounds were designed. Docking simulations were performed with the 78 compounds synthesized, leading to the prediction of the interaction between the proposed inhibitors and MtPPAT active site. Latelly, semi-empirical calculations were performed with the most promising compounds. These calculations were carried out to obtain information about the enthalpy interactions between compounds and MtPPAT active site. Computational studies led to the selection of the most promising inhibitors. Those compounds and some of their fragments were synthesized, purified, and characterized. The synthesized compounds had their in vitro microbiological activity and cytotoxicity evaluated. Some of the synthesized compounds showed activity against the Mtb sensitive and resistant strains in micromolar range. Besides that, the active compounds were not considered cytotoxic. To validate the potential inhibitors\' design and evaluate their capacity to inhibit MtPPAT, the enzyme was produced and purified. MtPPAT inhibitory assays were performed, leading to the first inhibitors of the enzyme, with activity in micromolar range, validating the target.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-11062018-113048 |
| Date | 11 May 2018 |
| Creators | Primi, Marina Candido |
| Contributors | Ferreira, Elizabeth Igne, Sant'Anna, Carlos Maurício Rabello de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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