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Previous issue date: 2015-05-22 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Angiotensin converting enzyme 1 (ACE1) is a dipeptidyl carboxypeptidase that
converts angiotensin I (decapeptide) to a vasoconstrictor octapeptide angiotensin
II. Thus, ACE presents an important role in blood pressure regulation. There are
many synthetic commercially available ACE inhibitors such as captopril, lisinopril
and enalapril. Due to their side effects, naturally occurring inhibitors have been
prospected. In order to endorse this research field we have developed a new tool
for ACE ligand screening. To this end, ACE was extracted from bovine lung,
purified and chemically immobilized in modified ferrite magnetic beads (ACEMBs).
The ACE-MBs have shown a Michaelian kinetic behavior towards hippurylhistidyl-
leucine (HHL) and was also able to catalyze the conversion of angiotensin
I to angiotensin II. Moreover, as proof of concept, the ACE-MBs was inhibited by
lisinopril with an IC50 of 10 nM. At the fishing assay, ACE-MBs were able not only
to fish out the reference inhibitor, but also three peptides from a pool of tryptic
digested BSA. ACE-MBs emerge as new straightforward tool for ACE kinetics
determination, inhibition and binder screening. / Enzima conversora de angiotensina 1 (angiotensin converting enzyme 1, ACE1) é
uma dipeptidil carboxipeptidase que catalisa a reação para conversão da
angiotensina I, um decapeptídeo inativo, para angiotensina II, um octapeptídeo
vasoconstritor. Assim, a ACE1 exerce um papel essencial na regulação da
pressão arterial e tratamento de hipertensão. Existem diversos inibidores de
ACE1 sintéticos disponíveis comercialmente, como captopril, lisinopril e enalapril.
No entanto, o uso contínuo desses fármacos pode causar diversos efeitos
adversos como falência renal, hipotensão e hipercalemia. Devido a isso,
inibidores de ACE1 de origem natural tem sido prospectados. Com o objetivo de
contribuir para esse campo de pesquisa, neste trabalho foi desenvolvido uma
ferramenta para a busca de ligantes de ACE1. Para isso, a ACE1 foi extraída de
pulmão bovino e subsequentemente purificada com o auxílio de filtros de exclusão
por tamanho e mais duas etapas de cromatografia de afinidade. Para acompanhar
o processo de purificação, ensaios de atividade utilizando o substrato sintético
hipuril-histidil-leucina (HHL) foram estabelecidos, e foi desenvolvido um método
cromatográfico para suas análises, através do monitoramento do ácido hipúrico
(HA), produto da reação catalisada. Após a sua purificação, a ACE foi
quimicamente imobilizada em partículas nanomagnéticas (NMB-ACE), que
permitiu a realização de ensaios enzimáticos para a sua caracterização, obtendose
um comportamento michaeliano para o substrato HHL. Além disso, a
especificidade do reator enzimático foi testado frente a seu substrato natural e
testes de inibição com o lisinopril foram realizados, obtendo um valor de IC50
próximo ao encontrado para a enzima livre. Por fim, a seletividade do reator
enzimático foi avaliada pelo ensaio de bioconjugação, resultando na pesca de 3
peptídeos presente em uma mistura de mais de 100 peptídeos. Sendo assim, os
estudos apresentados nesse trabalho confirmam o estabelecimento do NMB-ACE
como uma ferramenta para a busca de ligantes de ACE em misturas complexas.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufscar.br:ufscar/7338 |
| Date | 22 May 2015 |
| Creators | Almeida, Fernando Gonçalves de |
| Contributors | Cass, Quezia Bezerra |
| Publisher | Universidade Federal de São Carlos, Câmpus São Carlos, Programa de Pós-graduação em Química, UFSCar |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFSCAR, instname:Universidade Federal de São Carlos, instacron:UFSCAR |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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