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Previous issue date: 2011-07-15 / The bean is a species with little tolerance to water stress, soffering freat losses in grain yield. Therefore, the breeding programs seek to combine conventional methods with molecular biology techniques, to develop genotypes tolerance to water stress and so reduce damage due to this stress. This study aimed toe valuate and classify the genotypes of beans in tolerant and sensitive to stress, build a library of differentially expressed cDNA of discriminated genotypes, to sequence fragments of the library and figure out which genes are responsible for tolerance to water stress in beans in the period of flowering. To this characterization, nime genotypes were used (IAPAR 14, IAPAR 81, Pérola, IPR Colibri e IPR Juriti, IPR Chopim, IPR Gralha, IPR Tiziu e IPR Uirapuru). The genotypes were subjected to two water conditions: 1) irrigation according to crop need and, 2) water stress during flowering for a period of 15 days. The experimental designed used was randomized blocks with three replications. Were evaluated: i) Plant height; ii) Diameter of the stem; iii) Number of vegetables per plant; iv) Number of grains per pod; v) Length of the root and iv) Root dry mass. The data were analyzed using ANOVA and means comparison tests. The results showed that the stem diameter does not discriminate in bean, the genotypes tolerant and sensitive to water shortages. The Pérola genotype was classified as tolerant to water stress during flowering and should be included in block crossing breeding programs. Already, the IAPAR 81 and IPR Juriti were classified as sensitive. The Pérola and IAPAR 81 genotypes were used for RNA extraction. From the obtained RNA s, began the suppressive subtractive hybridization (SSH) using the PCR select cDNA Subtraction Kit Kit. After hybridization, the differentially expressed fragments were cloned using the pGEM ®-T Kit. Ater cloning and transformation using E.coli, the recombinant plasmid was removed from the bacteria using the alkaline lysis method. Then the clones were sequenced with the BigDye Kit. The electropherograms were evaluated in appropriated softwares and the sequences were compared to those in Genbank. The Pérola genotype presented differential expression of genes induced in response to stress, wich confer tolerance to the plant. Genotype IAPAR 81 also express genes under conditions of stress, however, these do not confer tolerance to drought stress. From this, we can conclude that the SSH techniques was effective in isolating fragments of differentially expressed genes in genotypes Pérola and IAPAR 81, been possible the construction of two libraries with cDNA fragments that express these genes. The sequencing of 81 clones allowed us to find 35 differentially expressed sequences in the genotype Pérola in response to water deficit and of those, nine correspond to possible novel genes related to tolerance to water stress in beans / Considerando o feijão uma espécie pouco tolerante ao estresse hídrico, o qual
ocasiona grandes perdas no rendimento de grãos, os programas de melhoramento buscam aliar
os métodos convencionais com as técnicas de biologia molecular, para desenvolver genótipos
tolerantes ao estresse hídrico e reduzir os danos em decorrência desse estresse. O presente
trabalho teve como objetivo avaliar e classificar os genótipos de feijão em tolerantes e
sensíveis ao estresse, construir uma biblioteca de cDNA diferencialmente expressos dos
genótipos discriminados, seqüenciar os fragmentos das bibliotecas e determinar quais são os
responsáveis pela tolerância ao estresse hídrico em feijão no período do florescimento. Para a
caracterização foram utilizados nove genótipos (IAPAR 14, IAPAR 81, Pérola, IPR Colibri e
IPR Juriti, IPR Chopim, IPR Gralha, IPR Tiziu e IPR Uirapuru). Eles foram submetidos a
duas condições hídricas: 1) irrigação conforme a necessidade da cultura e 2) estresse hídrico
no período do florescimento por um período de 15 dias. O delineamento experimental
utilizado foi de blocos ao acaso com três repetições. Foram avaliadas: i)Estatura da planta; ii)
Diâmetro do caule; iii)Número de legumes por planta; iv) Número de grãos por legume;
v)Comprimento da raiz e vi)Massa seca da raiz. Os dados foram submetidos à análise de
variância e teste de comparação de médias. Os resultados mostram que o caráter diâmetro do
caule não discrimina os genótipos de feijão em tolerantes e sensíveis à falta de água. O
genótipo Pérola foi classificado como tolerante ao estresse hídrico no período do
florescimento. Já o IAPAR 81 e IPR Juriti foram classificados como sensíveis. As folhas do
Pérola e IAPAR 81 da condição normal de irrigação e de estresse foram utilizados para a
extração de RNA. A partir dos RNA s obtidos, iniciou-se a hibridização subtrativa supressiva
(SSH) utilizando-se o kit PCR SelectcDNASubtraction Kit. Após a hibridização, os
fragmentos diferencialmente expressos foram clonados utilizando-se o Kit pGEM®-T. Após a
clonagem e transformação utilizando a E.coli, o plasmideo recombinante foi retirado da
bactéria utilizando-se o método da lise alcalina. Os clones foram seqüenciados com o Kit
BigDye. Os eletroferogramas obtidos foram analisados em programas computacionais e as
seqüências foram comparadas no Genbank. O genótipo Pérola apresentou expressão
diferencial de genes induzidos em resposta ao estresse, os quais lhe conferem a tolerância. O
genótipo IAPAR 81 também expressa genes em condição de estresse, no entanto, estes não
lhe conferem tolerância ao estresse hídrico. A partir disso podemos concluir que a técnica da
SSH foi eficiente no isolamento de fragmentos de genes diferencialmente expressos nos
genótipos Pérola e IAPAR 81, possibilitando a construção de duas bibliotecas de cDNA que
correspondem a esses genes. O seqüenciamento de 81 clones permitiu encontrar 35
seqüências diferencialmente expressas no genótipo Pérola em resposta ao déficit hídrico e
dessas, nove correspondem a possíveis novos genes relacionados a tolerância ao estresse
hídrico em feijão
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:tede.udesc.br #179.97.105.11:handle/1130 |
| Date | 15 July 2011 |
| Creators | Vale, Naine Martins do |
| Contributors | Coimbra, Jefferson Luís Meirelles |
| Publisher | Universidade do Estado de Santa Catarina, Mestrado em Produção Vegetal, UDESC, BR, Produção Vegetal |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UDESC, instname:Universidade do Estado de Santa Catarina, instacron:UDESC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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