El compost energètic que utilitzen les cèl·lules per realitzar les seves funcions biològiques bàsiques és l’ATP, produït a través de la respiració oxidativa mitocondrial. Durant aquest procés es produeixen de manera secundària espècies reactives d’oxigen (ROS) que són capaces d’atacar i danyar diferents estructures cel·lulars, entre elles el DNA. Si es produeix un desequilibri i les ROS generen dany considerem que la cèl·lula es troba condicions d’estrès oxidatiu.
La present tesi doctoral aporta nous coneixements sobre els mecanismes de reparació del dany al DNA en fase replicativa i en condicions d’estrès oxidatiu. Està centrada en l’estudi de dos mecanismes de reparació del dany: la ruta de senyalització de l’Anèmia de Fanconi (FA) i l’acció de l’antigen de proliferació nuclear (PCNA).
FA és una malaltia genètica rara i altament heterogènia causada per mutacions en 15 gens coneguts. Està caracteritzada per disfuncions al moll de l’os, susceptibilitat a càncer i fragilitat cromosòmica. Les cèl·lules FA presenten un defecte en la reparació dels enllaços creuats entre cadenes (ICLs) del DNA en fase replicativa. Les 15 proteïnes derivades actuen en una ruta de senyalització conjunta per la reparació dels ICLs. Es considera que la ruta està activada quan es produeix la monoubiquitinació de la proteïna central FANCD2. Fins l’actualitat no es coneix cap inductor de ICLs, tant endogen com exogen, que sigui capaç d’explicar el fenotip observat. En el present treball s’explora l’estrès oxidatiu endogen com una de les possibles causes per explicar el fenotip de FA. Es coneix que les cèl·lules FA presenten nivells elevats de la base oxidada 8-oxoG al DNA. Els resultats presentats aquí descarten un defecte en el processament de les lesions oxidatives per part de la ruta FA i, per tant, els nivells elevats de 8-oxoG en cèl·lules són deguts a una superproducció de dany. El dany oxidatiu indueix de manera secundària trencaments de doble cadena (DSBs) i es demostra un processament d’aquest tipus de lesió per part de la ruta FA.
L’Atàxia telengectasia (A-T) és una altra malaltia genètica rara caracteritzada per un defecte en la reparació del DNA i causada per mutacions en la proteïna de control del cicle cel·lular i de resposta a dany ATM. A-T presenta certs trets característics comuns amb FA tals com els nivells elevats de 8-oxoG en cèl·lules i pacients. El nostre treball planteja un model comú entre FA i A-T en la reparació del dany oxidatiu: ATM fosforila FANCD2 al residu S222 en resposta a lesions secundàries induïdes pel dany oxidatiu tals com els DSBs per a l’establiment del punt de control del cicle cel·lular en fase S del cicle. Aquest fet podria explicar el perquè el fenotip dels pacients FA amb mutacions al gen de FANCD2 presenten una major severitat respecte la resta de pacients del grup central de FA. Així doncs, FANCD2 és una proteïna amb funcions duals en la resposta a dany oxidatiu: està involucrat en la reparació per se dels DSBs (monoubiquitinació) i intervé en el correcte establiment del punt de control de fase S del cicle cel·lular (fosforilació).
L’última part del treball descriu una nova ruta de reparació del dany oxidatiu mitjançant la monoubiquitinació de PCNA depenent de fase replicativa del cicle cel·lular i de la lligasa d’ubiquitina RAD18. La monouibiquitinació de PCNA és un conegut mecanisme d’activació del procés de síntesi per translesió (TLS). Aquest procés està caracteritzat pel reclutament de les polimerases de TLS per a la síntesi de DNA circumval·lant la lesió. El treball proposa un model de la circumval·lació de les lesions oxidatives mitjançant la monoubiquitinació de PCNA i el reclutament de manera específica de la polimerasa de TLS DNA polι. / ATP is the molecular unit of currency of intracellular energy transfer. ATP is produced normally during the oxidative phosphorylation inside the mitocondria, the process induces by side effects reactive oxigen species (ROS) capable to induce damage to all cellular structures, including DNA. Cells have developed during evolution several mechanisms to control ROS damage. If these mechanisms fails, we consider the cell under oxidative stress conditions.
The thesis sheds light on the DNA repair mechanisms in replicative phase of cell cycle under oxidative stress conditions. Is focused on the study of two DNA repair pathways: the Fanconi Anemia (FA) pathway and the role of proliferating cell nuclear antigen (PCNA) in response to oxidative insults.
FA is a highly heterogenic rare genetic disease. Mutations in any of the 15 known FA gens cause FA. FA is characterized by bone marrow failure, chromosome fragility and increased cancer susceptibility. FA cells are sensitive to interstrand crosslinking (ICLs) agents. All 15 FA proteins cooperate in a common pathway to repair the ICLs lesions during replicative phases of cell cycle. We consider FA pathway activated when the central FA protein FANCD2 is monoubiquitinated in response to DNA damage. Until now, is not known any natural source of ICLs, either endogenous or exogenous, to explain FA phenotype. We tried to solve in the thesis if the endogenous oxidative damage could explain, at least partially, FA phenotype. Is known that FA cells present high level of the oxidated lesion 8-oxoG in their DNA. The results presented here discard a repair defect of FA cells in response to oxidative lesions such as 8-oxoG and other oxidative base lesions processed by BER. So and most probably, the high levels of 8-oxoG observed in FA cells are due to increase of 8-oxoG production rather than DNA repair defect of these kind of lesion. We showed here that DNA oxidative damage inducer H2O2 induces secondarily DNA double strand breaks and that this DNA lesion is processed by FA pathway.
Ataxia telengectasia (A-T) is another rare genetic disease characterized by DNA repair defects caused by mutations in the cell cycle and DNA repair protein ATM. A-T shares some phenotypic common tracks with FA such as the increased levels of 8-oxoG in their DNA. Our work suggest a common and coordinated model between A-T and FA in response to oxidative damage inducer H2O2: ATM phosphorylates residue S222 of FANCD2 protein in response to DSBs induced by oxidative damage to correctly establish the cell cycle checkpoint in S-phase to repair the damage. This model could also explain why FANCD2 patients have more sever phenotype respect FA core complex patients. In summary, we showed here that FANCD2 has dual functions in response to oxidative damage inducer H2O2, is both monoubiquitinated through ATR and FA pathway and phosphorylated through ATM kinase for proper response to oxidative endogenous insults.
The last part of the work describes a novel DNA repair pathway in response to oxidative damage mediated by PCNA and dependent on replicative phase of the cell cycle. PCNA is monoubiquitinated in response to oxidative DNA damage lesions by RAD18 ubiquitin ligase in a translesion synthesis (TLS) like process. Monoubiquitinated PCNA is then able to recruit TLS polymerases to bypass oxidative DNA lesions. We suggest here a putative and novel role for the unknown DNA polymerase iota to bypass such kind of oxidative lesions in an error free manner.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/83957 |
| Date | 26 January 2012 |
| Creators | Castillo Bosch, Pau |
| Contributors | Surrallés i Calonge, Jordi, Bogliolo, Massimo, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Genètica i de Microbiologia |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 162 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
Page generated in 0.013 seconds