Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind von einer Lipiddoppelmembran umschlossen und können Proteine, Nukleinsäuren, sowie Kohlenhydrate enthalten. Die sehr heterogenen EVs werden von einer Vielzahl eu- und prokaryotischer Zellen freigesetzt und sind aus allen menschlichen Körperflüssigkeiten isolierbar. EVs können über mehrere Mechanismen Informationen zwischen Zellen übertragen und spielen damit eine wichtige, aber größtenteils unerforschte Rolle in der Zell-Zell-Kommunikation. So erlauben die Oberflächenproteine der EVs einerseits Interaktionen mit membranständigen Rezeptoren auf Zellen, während EVs andererseits endozytiert werden können und ihr Inhalt somit nach intrazellulär transportiert werden kann. Der enge Informationsaustausch in der Zusammenarbeit verschiedener Zellen ist charakteristisch für das Immunsystem, in dem Monozyten eine zentrale Stellung vor allem bei der Abwehr bakterieller Infektionen einnehmen. Allerdings ist die Funktion von monozytären extrazellulären Vesikeln, wie auch viele ihrer Charakteristika, weitgehend unbekannt.
Mit dem Ziel, die monozytären extrazellulären Vesikel genauer zu charakterisieren, erfolgte die Separation primärer humaner Monozyten aus Leukozytenkonzentraten gesunder Blutspender mit Gegenstromelutriation oder Positivselektion über das Oberflächenmolekül CD14. Dabei zeigte sich, dass die Nutzung von Gegenstromelutriation zur Separation primärer humaner Monozyten vorteilhaft hinsichtlich höherer Ausbeute an Zellen und höherer Zellvitalität war, während die Positivselektion eine höhere Zellreinheit erlaubte. Nach Kultur der Monozyten in vesikelfreiem Medium wurden die EVs mittels differentieller Ultrazentrifugation aus den Zellkulturüberständen isoliert und charakterisiert. Die unspezifische Charakterisierung der EVs hinsichtlich der Größenverteilung und Quantität erfolgte mit nanoparticle tracking-Analyse und zeigte gut mit kleinen bis mittelgroßen EVs vereinbare Ergebnisse. In Einklang damit stellten sich die monozytären EVs als sphärische, nanoskalige Strukturen in der Raster-Heliumionenmikroskopie dar. Der Nachweis spezifischer Oberflächenmoleküle auf den EVs erfolgte mit einer bead-basierten durchflusszytometrischen Methode (MACSPlex). Die EVs positivselektierter Monozyten trugen MHC-II, CD63, CD81, CD24, CD44, sowie CD14, CD31 und CD11c auf ihrer Oberfläche. Dies belegte einerseits die Isolation extrazellulärer Vesikel und deutete gleichzeitig auf den monozytären Ursprung und mögliche Interaktionen der Vesikel hin. Die Sensitivität von CD14 als möglicher Marker für monozytäre EVs zeigte sich aufgrund geringer Signalintensität als wahrscheinlich ungenügend. Bei Charakterisierung der EVs von Monozyten, welche mit Gegenstromelutriation separiert wurden, zeigten sich regelmäßig zusätzlich Thrombozyten-spezifische Oberflächenmoleküle. Die Kontamination monozytärer EVs mit thrombozytären EVs konnte durchflusszytometrisch mit MACSPlex erkannt und durch Positivselektion der Monozyten vermieden werden. Das Tetraspanin CD9, welches allgemein einen wenig spezifischen Marker für EVs darstellt, zeigte sich bei Nachweis auf EVs primärer humaner Monozyten am ehesten als Ausdruck einer Kontamination mit thrombozytären EVs. Somit gelang der Nachweis mehrerer Oberflächenproteine auf monozytären EVs unter gleichzeitigem Ausschluss von Kontaminationen mit EVs anderer Blutzellen oder Thrombozyten. Eine Stimulation der positivselektierten, beziehungsweise mit Gegenstromelutriation separierten primären humanen Monozyten mit Lipopolysaccharid (LPS) führte zu einer im Mittel um 70 %, beziehungsweise um 86 % verstärkten Freisetzung extrazellulärer Vesikel in den Zellkulturüberstand. Dabei veränderte sich die Größenverteilung, die Oberflächenbeschaffenheit und die relative Expression der untersuchten Oberflächenproteine nicht signifikant. Extrazelluläre Vesikel, welche in Anwesenheit von LPS gewonnen wurden, wiesen auch nach dem Isolationsprozess eine relevante Endotoxinkonzentration auf, was wahrscheinlich einen erheblichen Einfluss auf andere LPS-sensible Zellen hätte. Daher wurden nur die ohne LPS gewonnenen monozytären EVs auf eine immunmodulatorische Funktion hin untersucht. Dafür wurden in-vitro differenzierte M1- beziehungsweise M2-Makrophagen nach Inkubation mit monozytären EVs einem LPS-Stimulus ausgesetzt. Die Zytokinantwort der Makrophagen wurde mit RT-PCR und ELISA für IL-1β, IL-10, IL-6, IL-8 und TNF-α analysiert. Extrazelluläre Vesikel primärer humaner Monozyten zeigten unter den gewählten experimentellen Bedingungen keinen statistisch signifikanten Einfluss auf die Zytokinantwort von in-vitro differenzierten M1- und M2-Makrophagen auf einen LPS-Stimulus. Dennoch nahm die Transkription der proinflammatorischen Zytokine in LPS-stimulierten M1-Makrophagen durch Vorinkubation mit monozytären EVs ab.
Die gewonnenen Ergebnisse unterstreichen die Komplexität der Forschung an extrazellulären Vesikeln von Primärzellen und unterstützen die Notwendigkeit genauer und kritischer Charakterisierung von EVs, beispielsweise mit durchflusszytometrischen Multiplex-Methoden für die Bestimmung von Oberflächenmolekülen. Weitere Studien sind nötig, um die intravesikulären Charakteristika monozytärer EVs und die Art derer Interaktion mit verschiedenen Zellen zu untersuchen. Das Verständnis der Rolle von EVs im Ablauf inflammatorischer Reaktionen könnte perspektivisch zu deren Einsatz im Rahmen zielgerichteter Immunmodulation oder Diagnostik führen.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:83366 |
| Date | 06 February 2023 |
| Creators | Rademacher, Phil |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0027 seconds