O Brasil possui uma posição privilegiada quando se refere à produção de etanol. Por questões históricas e geográficas o país é responsável por mais de 30 % da produção mundial de etanol, com uma produção nacional de mais de 28 bilhões de litros em 2014. Para maximizar o rendimento desse processo, está em desenvolvimento a tecnologia associada ao etanol de segunda geração ou etanol lignocelulósico. Os principais desafios desta tecnologia são: melhorar a eficiência de conversão do substrato em produto e a produção em grande escala utilizando substratos de baixo custo. Com o objetivo de melhorar a eficiência do processo de conversão foram estudadas proteínas auxiliares (expansinas) que, em conjunto com celulases, melhoram a despolimerização de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis. Além disso, realizou-se também a caracterização de enzimas ativas de carboidratos (CAZymes) de origem termofílica do organismo Thermogemmatispora sp. T81, devido a capacidade que estas proteínas apresentam de manter a atividade e conformação estrutural em altas temperaturas por um prolongado período de tempo. A partir de análises utilizando bioinformática, os genes que codificam para expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei foram clonados e expressos em E. coli, e seus produtos gênicos (as expansinas) tiveram seus índices de sinergismo (devido atuação conjunta com coquetéis comerciais) e atividade catalítica determinados. Adicionalmente, dispondo de alinhamentos estruturais, foi proposto um mecanismo hidrolítico para elas. Em relação à bactéria Thermogemmatispora sp. T81, foram realizadas análises genômicas e proteômicas, a fim de selecionar enzimas superexpressas em meio celulósico. Seus genes foram clonados heterologamente em E. coli e o produto de expressão caracterizado bioquimicamente (cromatografia, ensaios de atividade e perfil de hidrólise) e estruturalmente (SAXS e dicroísmo circular). Os índices de sinergismo determinados foram de 2,47; 1,96 e 2,44 para as expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei, respectivamente. A partir dos alinhamentos estruturais foi proposto a díade Asp/Glu como sitio catalítico em expansinas. As análises de proteômica possibilitaram a seleção de quatro alvos de clonagem, por apresentarem alto índice de expressão quando a bactéria foi cultivada em meio celulósico. Estas proteínas foram caracterizadas quanto a atividade e apresentaram um perfil comum: temperatura ótima de ação (de 70 a 75 °C), pH ótimo de 5, e hidrolisam preferencialmente substratos hemicelulósicos (xilano). A porcentagem de estruturais secundárias das proteínas em estudo foram confirmadas com predições teóricas ao se utilizar a técnica de dicroísmo circular. Desta maneira, os objetivos iniciais propostos neste projeto foram concluídos com a determinação do grau de sinergismo das proteínas expansinas em estudo e a proposição de um mecanismo de hidrólise para as mesmas, considerando que tais proteínas por mais de 20 anos tiveram sua atividade definida exclusivamente como acessória. Além disso, este estudo contribui com a identificação e seleção de genes para CAZymes termofilícas com aplicação biotecnológica devido às propriedades termoestáveis apresentadas. / Brazil holds a privileged position regarding the production of ethanol. Due to geographical and historical reasons the country produces more than 30% of the world’s ethanol, with a national yield of more than 28 billion liters in 2014 alone. To further increase gain in production, technology related to second generation (or lignocellulosic) ethanol is currently under development. The main challenges of this technology are: to improve the substrate-product conversion and large-scale production using low-cost substrates. In order to improve the efficiency of the former, auxiliary proteins (expansins), which enhance lignocellulosic biomass depolymerization to fermentable sugars when associated to celullases, were studied. Besides, due to structural and catalytic resilience when subjected to high temperature, the characterization of carbohydrate-active enzymes (CAZymes) of thermophilic origin from Thermogemmatispora sp. T81 organism was performed. Through the application of bioinformatics, genes coding for Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei expansins were cloned and expressed in E. coli, being the products assessed regarding their synergism (due to joint action with commercially available enzyme cocktails) and catalytic activity. Additionally, a hydrolytic mechanism was proposed based on structural alignments. Concerning the Thermogemmatispora sp. T81 bacteria, genomic and proteomic analysis were performed in order to select overexpressed enzymes in cellulosic medium. The heterologous cloning of the respective genes was then performed in E. coli, being the products characterized biochemically (utilizing chromatography, activity assay and hydrolysis profile) and structurally (through SAXS and circular dichroism). Determined synergistic indices were 2.47; 1.96 and 2.44 for Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei expansins, respectively. From structural alignments, the dyad Asp/Glu was proposed as the catalytic site in expansins. Proteomic analysis allowed the selection of four proteins for cloning, due to high expression levels when the bacteria were cultivated in a cellulosic medium. These proteins were characterized based on their activity and showed similar trends: optimal functional temperature (70-75 °C), optimal pH of 5, and preferential hydrolysis of hemicellulosic substrates (xylan). Theoretical predictions of secondary structure percentages of studied proteins were confirmed through circular dichroism technique. Therefore, the initially proposed objectives in this project were accomplished with the determination of synergistic level and proposed hydrolytic mechanism for the expansins, considering that the role of these proteins were deemed marginal for over 20 years. In addition, this study contributes with the identification and selection of genes of thermophilic CAZymes with biotechnological applications due to shown thermostability properties.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-03062016-144426 |
| Date | 11 March 2016 |
| Creators | Atílio Tomazini Junior |
| Contributors | Igor Polikarpov, David Bernard Levin, Mario Tyago Murakami, Roberto Ruller, Fernando Segato |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Física, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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