Made available in DSpace on 2018-08-01T23:29:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_10784_RESUMO.pdf: 11490 bytes, checksum: 49bc6457373749c2927bdec04d576615 (MD5) Previous issue date: 2017-03-16 / As celulases são enzimas capazes de hidrolisar a celulose, biopolímero mais abundante na natureza. A indústria alcooleira tem dado, atualmente, atenção especial às celulases para o processo produtivo do etanol de segunda geração. Existem diversos microrganismos produtores de celulases na natureza, destacandose os fungos filamentosos. Para que ocorra a produção dessas enzimas é necessário material celulósico no meio fermentativo. Esse indutor pode ser proveniente de meios complexos, como os resíduos agroindustriais, ou meios quimicamente definidos. Quando se utiliza resíduos é interessante que esse material passe por um processo de pré-tratamento com o objetivo de eliminar outros componentes que dificultam o ataque microbiano a celulose, principal fonte de carbono dos microrganismos para produção de celulases. O bagaço de cana-deaçúcar é um resíduo da indústria sucroalcooleira que vem sendo amplamente estudado como substrato para produção de celulases. Sendo assim, o presente trabalho teve como objetivo estudar as melhores condições operacionais (temperatura, concentração de bagaço de cana e teor de umidade) para produção de celulases a partir dos fungos Penicillium sp., Rhizomucor sp. e Trichoderma koningii INCQS 40331 (CFAM 422) utilizando bagaço de cana in natura e pré-tratado com solução ácido-base via fermentação no estado sólido e submersa. Para isso foi utilizado um planejamento experimental do tipo fatorial (3²) com mais dois pontos centrais, totalizando 11 experimentos para cada dupla microrganismo/substrato. O fungo Trichoderma koningii mostrou-se melhor produtor de celulases e quanto ao substrato, o bagaço in natura levou a melhores resultados. A fermentação no estado sólido apresentou melhor resultado (8,199 UI/gs) a 28ºC e 50% de umidade (base úmida). Com relação à fermentação submersa a melhor produção enzimática (3130,43 UI/L) foi observada também a 28ºC e 2,7% (m/v) de concentração de substrato.

Dissertação (Mestrado em Engenharia Química) - Centro Universitário FEI, São Bernardo do Campo, 2016.

O Brasil possui uma posição privilegiada quando se refere à produção de etanol. Por questões históricas e geográficas o país é responsável por mais de 30 % da produção mundial de etanol, com uma produção nacional de mais de 28 bilhões de litros em 2014. Para maximizar o rendimento desse processo, está em desenvolvimento a tecnologia associada ao etanol de segunda geração ou etanol lignocelulósico. Os principais desafios desta tecnologia são: melhorar a eficiência de conversão do substrato em produto e a produção em grande escala utilizando substratos de baixo custo. Com o objetivo de melhorar a eficiência do processo de conversão foram estudadas proteínas auxiliares (expansinas) que, em conjunto com celulases, melhoram a despolimerização de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis. Além disso, realizou-se também a caracterização de enzimas ativas de carboidratos (CAZymes) de origem termofílica do organismo Thermogemmatispora sp. T81, devido a capacidade que estas proteínas apresentam de manter a atividade e conformação estrutural em altas temperaturas por um prolongado período de tempo. A partir de análises utilizando bioinformática, os genes que codificam para expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei foram clonados e expressos em E. coli, e seus produtos gênicos (as expansinas) tiveram seus índices de sinergismo (devido atuação conjunta com coquetéis comerciais) e atividade catalítica determinados. Adicionalmente, dispondo de alinhamentos estruturais, foi proposto um mecanismo hidrolítico para elas. Em relação à bactéria Thermogemmatispora sp. T81, foram realizadas análises genômicas e proteômicas, a fim de selecionar enzimas superexpressas em meio celulósico. Seus genes foram clonados heterologamente em E. coli e o produto de expressão caracterizado bioquimicamente (cromatografia, ensaios de atividade e perfil de hidrólise) e estruturalmente (SAXS e dicroísmo circular). Os índices de sinergismo determinados foram de 2,47; 1,96 e 2,44 para as expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei, respectivamente. A partir dos alinhamentos estruturais foi proposto a díade Asp/Glu como sitio catalítico em expansinas. As análises de proteômica possibilitaram a seleção de quatro alvos de clonagem, por apresentarem alto índice de expressão quando a bactéria foi cultivada em meio celulósico. Estas proteínas foram caracterizadas quanto a atividade e apresentaram um perfil comum: temperatura ótima de ação (de 70 a 75 °C), pH ótimo de 5, e hidrolisam preferencialmente substratos hemicelulósicos (xilano). A porcentagem de estruturais secundárias das proteínas em estudo foram confirmadas com predições teóricas ao se utilizar a técnica de dicroísmo circular. Desta maneira, os objetivos iniciais propostos neste projeto foram concluídos com a determinação do grau de sinergismo das proteínas expansinas em estudo e a proposição de um mecanismo de hidrólise para as mesmas, considerando que tais proteínas por mais de 20 anos tiveram sua atividade definida exclusivamente como acessória. Além disso, este estudo contribui com a identificação e seleção de genes para CAZymes termofilícas com aplicação biotecnológica devido às propriedades termoestáveis apresentadas. / Brazil holds a privileged position regarding the production of ethanol. Due to geographical and historical reasons the country produces more than 30% of the world’s ethanol, with a national yield of more than 28 billion liters in 2014 alone. To further increase gain in production, technology related to second generation (or lignocellulosic) ethanol is currently under development. The main challenges of this technology are: to improve the substrate-product conversion and large-scale production using low-cost substrates. In order to improve the efficiency of the former, auxiliary proteins (expansins), which enhance lignocellulosic biomass depolymerization to fermentable sugars when associated to celullases, were studied. Besides, due to structural and catalytic resilience when subjected to high temperature, the characterization of carbohydrate-active enzymes (CAZymes) of thermophilic origin from Thermogemmatispora sp. T81 organism was performed. Through the application of bioinformatics, genes coding for Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei expansins were cloned and expressed in E. coli, being the products assessed regarding their synergism (due to joint action with commercially available enzyme cocktails) and catalytic activity. Additionally, a hydrolytic mechanism was proposed based on structural alignments. Concerning the Thermogemmatispora sp. T81 bacteria, genomic and proteomic analysis were performed in order to select overexpressed enzymes in cellulosic medium. The heterologous cloning of the respective genes was then performed in E. coli, being the products characterized biochemically (utilizing chromatography, activity assay and hydrolysis profile) and structurally (through SAXS and circular dichroism). Determined synergistic indices were 2.47; 1.96 and 2.44 for Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei expansins, respectively. From structural alignments, the dyad Asp/Glu was proposed as the catalytic site in expansins. Proteomic analysis allowed the selection of four proteins for cloning, due to high expression levels when the bacteria were cultivated in a cellulosic medium. These proteins were characterized based on their activity and showed similar trends: optimal functional temperature (70-75 °C), optimal pH of 5, and preferential hydrolysis of hemicellulosic substrates (xylan). Theoretical predictions of secondary structure percentages of studied proteins were confirmed through circular dichroism technique. Therefore, the initially proposed objectives in this project were accomplished with the determination of synergistic level and proposed hydrolytic mechanism for the expansins, considering that the role of these proteins were deemed marginal for over 20 years. In addition, this study contributes with the identification and selection of genes of thermophilic CAZymes with biotechnological applications due to shown thermostability properties.

Submitted by Tania Ivani Rokohl (tania.rokohl@uffs.edu.br) on 2018-03-14T12:41:29Z No. of bitstreams: 1 VENTURIN.pdf: 611920 bytes, checksum: daa49ea9b4d92221b936f559186c3cc8 (MD5) / Approved for entry into archive by Diego dos Santos Borba (dborba@uffs.edu.br) on 2018-03-14T13:59:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 VENTURIN.pdf: 611920 bytes, checksum: daa49ea9b4d92221b936f559186c3cc8 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-03-14T13:59:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 VENTURIN.pdf: 611920 bytes, checksum: daa49ea9b4d92221b936f559186c3cc8 (MD5) Previous issue date: 2018-01-08 / A necessidade de fontes energéticas renováveis é evidente nos dias de hoje, visto que os combustíveis derivados do petróleo são fontes esgotáveis. A biomassa lignocelulósica é uma fonte promissora de energia, pois possui alto teor de celulose, a qual pode ser convertida a biogás. Atualmente, a produção de biogás está associada ao tratamento de um dos grandes problemas da suinocultura no Brasil, o gerenciamento da elevada concentração de efluente gerado pelos sistemas de produção de animais confinados. Neste trabalho, primeiramente avaliou-se diferentes tipos de pré-tratamentos sobre uma matéria prima lignocelulósica, o caule de milho (Zea mays), utilizando metodologia de planejamento de experimentos e posteriormente investigou-se o potencial de produção de biogás através da co-digestão com dejeto suíno. O pré-tratamento com H2SO4 teve uma remoção significativa da fração de hemicelulose usando baixas concentrações de ácido (0,75% v.v-1). Porém, por também aumentar a fração de lignina na biomassa, esta técnica não é adequada para posterior produção de biogás, pois acaba inibindo o processo de co-digestão. Já o pré-tratamento com H2O2 alcalino (pH 11,5) conseguiu um aumento da fração de celulose de 73,4% e uma redução de 71,6% no teor de lignina. Utilizando 12% (v.v-1) de H2O2, 58 ºC de temperatura do agitador orbital, agitação de 130 rpm e concentração de sólidos de 3% (3 g de massa seca em 100 mL de solução) por 58 min. Este pré-tratamento é recomendado para produção de biogás, pois conseguiu-se aumentar o volume final de biogás em 22%, bem como reduzir em um terço o tempo de digestão, em comparação com a biomassa não tratada. Não houve diferença significativa entre a utilização do material contendo todos os tamanhos de partículas e o material com apenas o tamanho de partícula mais abundante (0,890 mm). O sistema de ultrassom com potência máxima de irradiação de 132 W, não é indicado para realização de pré-tratamentos, pois não promove alterações na composição estrutural do caule de milho. Ao final deste estudo obteve-se uma alternativa promissora para que os carboidratos presentes nesta biomassa estivessem mais acessíveis para a digestão anaeróbia e como consequência o aumento da produção de biogás. / The need for renewable energy sources is evident today since oil-derived fuels are depleting sources. Lignocellulosic biomass is a promising energy source because it has a high content of cellulose, which can be converted to biogas. Currently, biogas production is associated with the treatment of one of the greatest swine problems in Brazil, the management of the high effluent load generated by the confined animal production systems. In this work, different types of pre-treatments of a lignocellulosic raw material, the corn stalk (Zea mays), were investigated using experimental design methodology, as well as the potential of biogas production through co-digestion with swine waste. Pretreatment with H2SO4 showed a significant removal of the hemicellulose fraction using low acid concentrations (0.75%). However, because it also increased the lignin fraction in the biomass, this technique is not suitable for the subsequent production of biogas, since it ends up inhibiting the co-digestion process. On the other hand, pre-treatment with alkaline H2O2 (pH 11.5) achieved an increase in the cellulose fraction of 73.4% and a reduction of 71.6% in lignin content using 12% (v.v-1) of H2O2, 58 °C of orbital agitator temperature, 130.0 rpm stirring and 3.0% of solids content (3 g of dry mass at 100 mL of solution) for 58.0 min. This pretreatment is recommended for biogas production as it provided a 22% increase in the final volume of biogas and a one-third reduction in the digestion time in comparison to the untreated biomass. There was no significant difference between the use of the material containing all particle sizes and the material with only the most abundant particle size (0.890 mm). The ultrasound system with maximum irradiation power of 132 W is not indicated for lignocellulosic pre-treatments as it does not promote changes in the structural composition of the corn stalk. At the end of this study, a promising alternative was obtained in order to make the carbohydrates present in the corn stalk more accessible for the anaerobic digestion and, as a consequence, to increase the biogas production.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Biologia, Departamento de Biologia Celular, 2012. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-02-29T15:51:20Z No. of bitstreams: 1 2015_JulianadeAmorimAraújo.pdf: 5184526 bytes, checksum: 9e3b8bda25f2e8c49a285a740aa3e3c2 (MD5) / Rejected by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br), reason: A pedido. Raquel on 2016-02-29T17:47:18Z (GMT) / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-02-29T17:49:08Z No. of bitstreams: 1 2012_JulianadeAmorimAraújo.pdf: 5184526 bytes, checksum: 9e3b8bda25f2e8c49a285a740aa3e3c2 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-02-29T19:34:32Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_JulianadeAmorimAraújo.pdf: 5184526 bytes, checksum: 9e3b8bda25f2e8c49a285a740aa3e3c2 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-29T19:34:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_JulianadeAmorimAraújo.pdf: 5184526 bytes, checksum: 9e3b8bda25f2e8c49a285a740aa3e3c2 (MD5) / A produção de etanol lignocelulósico transformou-se em um grande desafio para a indústria de energia renovável. A celulose presente nos resíduos lignocelulósicos representa uma fonte abundante de açúcares, mas estes só se tornam disponíveis para fermentação após a etapa de hidrólise enzimática. As grandes quantidades de enzimas necessárias impactam severamente a relação custo-eficácia desta tecnologia. No sentido de buscar novas alternativas, conduzimos o trabalho com o intuito de construir linhagens das leveduras Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris capazes de produzir celulases (endoglicanase, celobiohidrolase e β-glicosidase). A primeira etapa para a produção de uma linhagem de S. cerevisiae produtora de celulases, foi a expressão isolada de genes celulolíticos. A expressão da endoglicanase II (eglII) de Trichoderma reesei e da celobiohidrolase I.1 (cbhI.1) de Phanerochaete chrysosporium em S. cerevisiae linhagem MFL gerou clones produtores de enzimas funcionais no sobrenadante do cultivo. Em ambos os clones selecionados para cada enzima, foi detectada atividade enzimática a partir de 24 h de cultivo, atingindo maior atividade após 96 h. Várias estratégias para expressão de β-glicosidases em S. cerevisiae foram abordadas: i) a expressão da BGL1 de Sacharomycopsis fibuligera em sua forma nativa, ii) fusionada ao C-terminal da α-aglutinina e, iii) com o peptídeo sinal do fator α de S. cerevisiae. As duas últimas estratégias também foram realizadas com a BGL4 do fungo Humicola grisea var. thermoidea. Testou-se, ainda, a co-expressão da β-glicosidase intracelular GH1-1 e do transportador de celodextrinas CDT-1 de Neurospora crassa. Dentre todos os genes e estratégia utilizados, apenas o sistema envolvendo a co-expressão da GH1-1 e do CDT-1 apresentou resultado satisfatório. O sistema provou ser eficiente permitindo que a levedura crescesse na presença de celobiose em condições aeróbicas e anaeróbicas, com produção de etanol na segunda condição. A co-expressão dos genes eglII e cbhI.1 foi em seguida testada na forma de “fusões gênicas” utilizando dois sistemas de clivagem in vivo: a sequência autoclivante 2A do vírus FMDV, e o sítio para a endoprotease Kex2p. Os dois sistemas resultaram em enzimas funcionais, no entanto as atividades foram menores do que aquelas obtidas quando as enzimas foram expressas separadamente (possivelmente devido ao saturamento da via de secreção). Finalmente, no sentindo de obter uma linhagem de S. cerevisiae que expressasse as três cellulases, foi feita a co-expressão das fusões gênicas com o sistema β-glicosidase/transportador. O clone selecionado GH1-Fus2A apresentou atividade enzimática sobre os substratos CMC e pNPC, capacidade de crescimento em celobiose e seu consumo, e produção de etanol, indicando a produção das três enzimas celulolíticas funcionais na mesma levedura. Para a obtenção de uma linhagem de P. pastoris recombinante produtora de celulases, os genes dessas enzimas foram clonados sob o controle do forte promotor induzível AOX1, em vetores integrativos. Foram utilizados os genes eglII e cbhI.1 em fusão gênica com a sequencia 2A. As atividades sobre CMC, Sigmacel e papel de filtro foram detectadas no sobrenadantes da linhagem recombinante, nas primeiras horas de indução, sendo os maiores níveis encontrados após 72 h, confirmando a atividade das enzimas EGLII e CBHI.1. A atividade sobre CMC do clone recombinante de P. pastoris foi aproximadamente 8 vezes superior àquela obtida com o clone recombinante de S. cerevisiae expressando a mesma fusão gênica. A análise do sobrenadante do cultivo por SDS-PAGE mostrou a clivagem da proteína de fusão pelo peptídeo 2A gerando proteínas independentes. Por fim, demonstrou-se a construção de linhagens de S. cerevisiae e de P. pastoris produtora de celulases necessárias para a degradação da celulose. Essas leveduras são apontadas como uma interessante plataforma para a produção de proteínas heterólogas, e com isso diminuir a quantidade de enzimas comerciais necessárias para hidrolisar o substrato, contribuindo para a redução da dependência da importação das enzimas. _______________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The production of lignocellulosic ethanol become a great challenge for the renewable energy industry. Cellulose present in the lignocellulosic residues represents an abundant source of sugars, but these are only available for the fermentation process after an enzymatic hydrolysis step. The large amount of enzymes required severely impacts the overall cost-efficacy relation of this technology. In an effort to pursue new alternatives, we performed this work aiming to construct strains of Saccharomyces cerevisae and Pichia pastoris able to produce cellulases (endoglucanase, celobiohydrolase and β-glucosidase). The first step for the production of the S. cerevisiae strain that produces cellulose was the isolated expression of cellulolitcs genes. The single expression of the endoglucanase II of Trichoderma reesei and of the cellobiohydrolase I.1 of Phanerochaete chrysosporium in S. cerevisiae MFL generated clones producing functional enzymes on the culture supernatant. In both selected clones for each enzyme, the enzymatic activity was detected after 24 h of cultivation, reaching the highest activity after 96 h. Many strategies for the expression of β-glucosidases in S. cerevisiae were performed: i) the expression of BGL1 de Sacharomycopsis fibuligera in its native form, ii) fused to C-terminal of α-aglutinin and, iii) with the signal peptide form the S. cerevisiae α-factor. The last two strategies were also performed with BGL4 from the fungus Humicola grisea var. thermoidea. It was also tested the co-expression of the intracellular β-glucosidase GH1-1 and the cellodextrins transporter CDT-1 of Neurospora crassa. Of all those strategies, only the system involving the co-expression of GH1-1 and CDT-1 showed satisfactory results. The system showed to be efficient allowing the growth of the yeast in the presence of cellobiose both in aerobic and anaerobic conditions, with ethanol production in the latter. Then, the co-expression of eglII and cbhI.1 genes was tested in the form of “gene fusions” using two in vivo cleavage systems: the auto-cleavage 2A sequence from the FMDV virus, and the cleavage site for the Kex2p protease. Both systems result in functional enzymes, however the activities were lower than those obtained when the enzymes were expressed separately, possibly due the saturation of the secretion pathway. Finally, in an effort to obtain a S. cerevisiae strain that expresses the three cellulases, it was made the co-expression of gene fusion with the β-glucosidase/transporter system. The selected clone GH1-Fus2A showed enzymatic activity with the substrates CMC and pNPC, capacity of growing in cellobiose and consumes it, and ethanol production, indicating the production of the three functional cellulolitic enzymes in the same yeast. To obtain a recombinant P. pastoris strain producing cellulases, the genes of these enzymes were cloned into an integrative vector under the control of the strong inducible promoter AOX1. It was used the eglII and cbhI.1 genes in a gene fusion with the autoclivable 2A sequence. Enzymatic activities with the substrates CMC, Sigmacel and filter paper were detected on the supernatant of the recombinant strain, confirming the enzymes activities of EGLII and CBH.1. The enzymatic activities were detected during the first hours of induction, where the highest levels occurred after 72h. The activity with CMC of the recombinant clone of P. pastoris was approximately 8-fold higher than that obtained with the recombinant clone in S. cerevisiae expressing the same gene fusion. Analysis of the culture supernatant through SDS-PAGE showed the protein fusion cleavage by the 2A peptide generating independent proteins. Finally, it was shown the construction of S. cerevisiae and P. pastoris strains producing cellulases necessary for the cellulose degradation. These yeasts are pointed out as an interesting platform for heterologous protein production and diminishing the amount of commercial enzymes needed to hydrolyze the substrate contribute to the decrease of the dependence of enzymes importation.

O Brasil possui uma posição privilegiada quando se refere à produção de etanol. Por questões históricas e geográficas o país é responsável por mais de 30 % da produção mundial de etanol, com uma produção nacional de mais de 28 bilhões de litros em 2014. Para maximizar o rendimento desse processo, está em desenvolvimento a tecnologia associada ao etanol de segunda geração ou etanol lignocelulósico. Os principais desafios desta tecnologia são: melhorar a eficiência de conversão do substrato em produto e a produção em grande escala utilizando substratos de baixo custo. Com o objetivo de melhorar a eficiência do processo de conversão foram estudadas proteínas auxiliares (expansinas) que, em conjunto com celulases, melhoram a despolimerização de biomassa lignocelulósica em açúcares fermentescíveis. Além disso, realizou-se também a caracterização de enzimas ativas de carboidratos (CAZymes) de origem termofílica do organismo Thermogemmatispora sp. T81, devido a capacidade que estas proteínas apresentam de manter a atividade e conformação estrutural em altas temperaturas por um prolongado período de tempo. A partir de análises utilizando bioinformática, os genes que codificam para expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei foram clonados e expressos em E. coli, e seus produtos gênicos (as expansinas) tiveram seus índices de sinergismo (devido atuação conjunta com coquetéis comerciais) e atividade catalítica determinados. Adicionalmente, dispondo de alinhamentos estruturais, foi proposto um mecanismo hidrolítico para elas. Em relação à bactéria Thermogemmatispora sp. T81, foram realizadas análises genômicas e proteômicas, a fim de selecionar enzimas superexpressas em meio celulósico. Seus genes foram clonados heterologamente em E. coli e o produto de expressão caracterizado bioquimicamente (cromatografia, ensaios de atividade e perfil de hidrólise) e estruturalmente (SAXS e dicroísmo circular). Os índices de sinergismo determinados foram de 2,47; 1,96 e 2,44 para as expansinas de Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei, respectivamente. A partir dos alinhamentos estruturais foi proposto a díade Asp/Glu como sitio catalítico em expansinas. As análises de proteômica possibilitaram a seleção de quatro alvos de clonagem, por apresentarem alto índice de expressão quando a bactéria foi cultivada em meio celulósico. Estas proteínas foram caracterizadas quanto a atividade e apresentaram um perfil comum: temperatura ótima de ação (de 70 a 75 °C), pH ótimo de 5, e hidrolisam preferencialmente substratos hemicelulósicos (xilano). A porcentagem de estruturais secundárias das proteínas em estudo foram confirmadas com predições teóricas ao se utilizar a técnica de dicroísmo circular. Desta maneira, os objetivos iniciais propostos neste projeto foram concluídos com a determinação do grau de sinergismo das proteínas expansinas em estudo e a proposição de um mecanismo de hidrólise para as mesmas, considerando que tais proteínas por mais de 20 anos tiveram sua atividade definida exclusivamente como acessória. Além disso, este estudo contribui com a identificação e seleção de genes para CAZymes termofilícas com aplicação biotecnológica devido às propriedades termoestáveis apresentadas. / Brazil holds a privileged position regarding the production of ethanol. Due to geographical and historical reasons the country produces more than 30% of the world’s ethanol, with a national yield of more than 28 billion liters in 2014 alone. To further increase gain in production, technology related to second generation (or lignocellulosic) ethanol is currently under development. The main challenges of this technology are: to improve the substrate-product conversion and large-scale production using low-cost substrates. In order to improve the efficiency of the former, auxiliary proteins (expansins), which enhance lignocellulosic biomass depolymerization to fermentable sugars when associated to celullases, were studied. Besides, due to structural and catalytic resilience when subjected to high temperature, the characterization of carbohydrate-active enzymes (CAZymes) of thermophilic origin from Thermogemmatispora sp. T81 organism was performed. Through the application of bioinformatics, genes coding for Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei expansins were cloned and expressed in E. coli, being the products assessed regarding their synergism (due to joint action with commercially available enzyme cocktails) and catalytic activity. Additionally, a hydrolytic mechanism was proposed based on structural alignments. Concerning the Thermogemmatispora sp. T81 bacteria, genomic and proteomic analysis were performed in order to select overexpressed enzymes in cellulosic medium. The heterologous cloning of the respective genes was then performed in E. coli, being the products characterized biochemically (utilizing chromatography, activity assay and hydrolysis profile) and structurally (through SAXS and circular dichroism). Determined synergistic indices were 2.47; 1.96 and 2.44 for Xanthomonas campestris, Bacillus licheniformis e Trichoderma reesei expansins, respectively. From structural alignments, the dyad Asp/Glu was proposed as the catalytic site in expansins. Proteomic analysis allowed the selection of four proteins for cloning, due to high expression levels when the bacteria were cultivated in a cellulosic medium. These proteins were characterized based on their activity and showed similar trends: optimal functional temperature (70-75 °C), optimal pH of 5, and preferential hydrolysis of hemicellulosic substrates (xylan). Theoretical predictions of secondary structure percentages of studied proteins were confirmed through circular dichroism technique. Therefore, the initially proposed objectives in this project were accomplished with the determination of synergistic level and proposed hydrolytic mechanism for the expansins, considering that the role of these proteins were deemed marginal for over 20 years. In addition, this study contributes with the identification and selection of genes of thermophilic CAZymes with biotechnological applications due to shown thermostability properties.

Com o crescente aumento da demanda energética e a redução dos recursos fósseis, os biocombustíveis obtidos a partir de biomassa lignocelulósica emergem como uma importante fonte de energia alternativa e sustentável. A biomassa lignocelulósica é formada basicamente por celulose, hemicelulose e lignina, cujo agrupamento compõem a complexa matriz da parede vegetal. A celulose é o principal composto de interesse presente na biomassa, uma vez que pode ser quebrada em glicose e usada no metabolismo de microrganismos para a posterior produção de etanol combustível. No entanto, diversos fatores tornam a biomassa recalcitrante ao processo de conversão, o que eleva o custo de produção dos biocombustíveis. Nesse contexto, proteínas aditivas, como as Expansinas vegetais vêm ganhando grande destaque devido à sua capacidade de afrouxar a parede celular por meio do enfraquecimento da ligação entre os polissacarídeos de forma não covalente, o que diminuí o estresse da parede celular e facilita assim a quebra da celulose por enzimas específicas. Assim, o presente trabalho teve como objetivo identificar genes da superfamília das Expansinas em quatro espécies de gramíneas (Zea mays, Sorghum bicolor, Brachypodium distachyon e Saccharum spp.). As sequências nucleotídicas obtidas a partir de bancos transcriptômicos de cana-deaçúcar foram usados na construção de árvores filogenéticas, por meio das quais pode se inferir as relações de ortologia entre espécies e selecionar sequências com potencial aplicação biotecnológica na promoção da sacarificação enzimática, aumento de biomassa e resistência vegetal à estresse abiótico, sendo estes ShEXPA14, ShEXPA24, ShEXPB22, ShEXPL3, ShEXPA1- zm, ShEXPA33, ShEXPB28, ShEXPB3, ShEXPB21, ShEXPB25 e ShEXPB4. Adicionalmente, os genes de sorgo e cana-de-açúcar foram caracterizados quanto aos domínios e motivos conservados das Expansinas de plantas, identificando as diferenças estre as subfamílias que podem contribuir para a maior especificidade das ?-expansinas em parede celular de gramíneas. / With increasing energy demand and the reduction of fossil resources, biofuels obtained from lignocellulosic biomass emerge as an important source of alternative and sustainable energy. The lignocellulosic biomass is basically formed by cellulose, hemicellulose and lignin, whose grouping makes up the complex matrix of the vegetal cell wall. Cellulose is the main compound of interest present in biomass since it can be broken down into glucose and used in the metabolism of microorganisms for the subsequent production of fuel ethanol. However, several factors make the biomass recalcitrant to the conversion process, which raises the biofuel production cost. In this context, additive proteins, such as vegetable Expansins have been gaining prominence due to their ability to loosen the cell wall by weakening the bond between the polysaccharides in a non-covalent way, which decreases the stress of the cell wall and thus facilitates the break of cellulose by specific enzymes. Thus, the present work aimed to identify nucleotide sequences of the Expansinas superfamily in four species of grasses (Zea mays, Sorghum bicolor, Brachypodium distachyon and Saccharum spp.). Sugarcane transcripts were used in the construction of phylogenetic trees, through which one can infer the relations of orthology between species and obtain sequences with potential biotechnological application in the promotion of enzymatic saccharification, biomass increase and plant resistance to abiotic stress, these being ShEXPA14, ShEXPA24, ShEXPB22, ShEXPL3, ShEXPA1-zm, ShEXPA33, ShEXPB28, ShEXPB3, ShEXPB21, ShEXPB25 and ShEXPB4. In addition, sorghum and sugarcane genes were characterized by the conserved domains and motifs of plant Expansins, identifying the differences between the subfamilies that may contribute to the greater specificity of the EXPB in the cell wall of grasses.

Este estudo buscou definir as melhores condições para a fermentação alcoólica da xilose pela levedura S. stipitis DSM-3651, utilizando suplementação nutricional de baixo custo. Inicialmente, o melaço de cana foi escolhido, devido à sua disponibilidade e inserção no contexto do etanol de segunda geração. Sendo assim, o estudo acerca dos requerimentos nutricionais foi realizado em quatro etapas. A primeira foi avaliar a capacidade da levedura em utilizar os açúcares provenientes de materiais lignocelulósicos e do melaço: xilose, arabinose, glicose, frutose e sacarose. Observou-se que a levedura foi capaz de converter apenas glicose, xilose e frutose em etanol, e inclusive realizar a co-fermentação destes. Desta forma, a segunda etapa foi determinar a composição química do melaço e compará-la com a de um suplemento referência (extratos de levedura e malte, e peptona). Enquanto o conteúdo de minerais foi semelhante o teor de nitrogênio foi bem inferior, de modo que o enriquecimento com fosfato de amônio foi requerido. A próxima etapa confrontou a qualidade nutricional de meios suplementados com melaço e fosfato ou com a suplementação referência, utilizando xilose como fonte de carbono. Embutida nesta análise foram testadas diferentes cargas de inóculo (0,07 e 3,00 g/L) provenientes de cultivos com ou sem limitação de nutrientes. Como resposta obtivemos que, de modo geral, o desempenho fermentativo de S. stipitis DSM-3651 foi reduzido quando apenas melaço e fosfato foram disponibilizados como nutrientes. Desta forma a quarta e última etapa baseou-se na metodologia de planejamento experimental para definir a combinação de nutrientes ideal para cada carga de inóculo. Com base na produção de etanol, definiu-se que, para o prosseguimento do trabalho um meio à base, principalmente, de melaço seria o mais adequado, utilizando uma concentração celular inicial de 3,00 g/L. O estudo dos efeitos das condições de fermentação no crescimento celular e na produção de etanol a partir de xilose, foi realizado com base no planejamento de experimentos e adequada análise estatística, utilizando 4 variáveis: aeração e concentrações de substrato, células e suplemento. Após avaliar e interpretar o impacto que cada variável exerceu no desenvolvimento da levedura, o aumento da produção de etanol foi o critério escolhido para estabelecer as condições que seriam fixadas para a continuidade do trabalho, atendendo nosso objetivo principal; redução da aeração e aumento das concentrações de substrato, células e nutrientes. Considerando que o melaço perfazia a maior porção mássica do suplemento nutricional, e que frutose, glicose e sacarose são os seus principais componentes, avaliou-se a possibilidade de inverter este dissacarídeo, utilizando invertases. O resultado foi uma eficiente hidrólise em glicose e frutose, atingindo 100% rendimento. Deste modo, o estudo de otimização da produção de etanol por S. stipitis DSM-3651, a partir de meio a base de xilose, procedeu-se na forma de uma nova abordagem para a integração das produções de etanol de primeira e segunda geração. Utilizando-se da capacidade intrínseca da levedura de co-fermentar xilose, glicose e frutose, um aumento da concentração de substrato foi obtido a partir do tratamento enzimático do melaço, que passou a exercer função dupla no processo fermentativo: fonte de nutriente e de açúcares fermentescíveis. Como resultado, a condição otimizada pelo presente trabalho atingiu fator de conversão e produtividade volumétrica de etanol de 0,41 g/g e 1,26 g/L.h, respectivamente, referentes à concentração final de 60,36 g/L de etanol. / This study seek to define the best conditions for the xylose fermentation by yeast S. stipitis DSM-3651, using an inexpensive nutritional supplementation. Initially, the sugarcane molasses was chosen due to its availability and integration in the second generation ethanol context. Thus, the study of the nutritional requirements was conducted in four stages. The first was to evaluate the yeast\'s ability to use sugars from lignocellulosic materials and sugarcane molasses: xylose, arabinose, glucose, fructose and sucrose. It was observed that the yeast was capable of converting only glucose, xylose and fructose in ethanol, and even carry out their co-fermentation. Thus, the second stage was to determine the chemical composition of sugarcane molasses and compare it with a reference supplement (malt and yeast extracts and peptone). While the mineral content was similar, the nitrogen content was much lower, so that the enrichment of ammonium phosphate was required. In the next step a comparison was established among media supplemented with sugar molasses plus phosphate or reference supplementation considering their nutritional qualities, using xylose as a carbon source. Embedded in this analysis were tested different inoculum loads (0.07 and 3.00 g/L) from cultures with or without nutrient limitation. We obtained that, in general, the fermentative performance of S. stipitis DSM-3651 was reduced when only sugarcane molasses and phosphate were provided as nutrients. Thus the fourth and final step was based on the experimental design methodology to define the optimum combination of nutrients for each inoculum load. Based in ethanol production, it was decided that a media composed mainly by sugarcane molasses would be more appropriate, using an initial cell concentration of 3.00 g/L. The study of the effects of fermentation conditions on cell growth and ethanol production from xylose was conducted based on the design of experiments, and appropriate statistical analysis using four variables: aeration and substrate, cells and supplement concentrations. After evaluating and interpreting the impact which each variable exercised in the yeast development, the increased ethanol production was chosen as criteria to establish the conditions that would be fixed for the research continuation, following our main aim; reducing aeration and increasing substrate, cells and nutrients concentrations. Whereas sugarcane molasses composing the greatest mass portion of the nutritional supplement, and fructose, glucose and sucrose are its main components, we evaluated the ability to invert this disaccharide using invertase. The result was an efficient hydrolysis into glucose and fructose, reaching 100% yield. Thus, the optimization studies of ethanol production by S. stipitis DSM-3651 from a medium composed by xylose was arranged as a novel approach for integrating the first and second generation ethanol production. Using the yeast intrinsic capacity of to perform the co-fermentation of xylose, glucose and fructose, an increase in the substrate concentration was obtained from the enzymatic treatment of the sugarcane molasses, which had a double duty in the fermentation process: nutrient and fermentable sugars source. As a result, the best condition determined by this study reached an ethanol yield and productivity of 0.41g/g and 1.26 g/L.h, respectively, for an ethanol final concentration of 60.36 g/L.

É crescente a busca por fontes de energia renováveis em substituição a o uso dos combustíveis fósseis, devido a grande preocupação mundial com o aquecimento global e as mudanças climáticas. O Brasil é considerado o detentor do processo de produção de etanol mais economicamente viável. Estimativas apontam para o fato de que a produção de etanol de primeira geração não será suficiente para atender a futura demanda global pelo biocombustível. Diante disto, a produção de etanol a partir da biomassa lignocelulósica se mostra como uma potencial solução. No entanto, durante o pré-tratamento e a hidrólise da biomassa, há formação de vários compostos tóxicos tais como o furfural, HMF, ácido fracos, e compostos fenólicos, os quais exercem efeitos inibitórios sobre as leveduras, tendo como consequência queda no rendimento fermentativo. Além das vantagens tecnológicas que o processo industrial brasileiro apresenta quanto à incorporação da produção de etanol 2G nas plantas já existentes, soma-se a abundância de matéria prima proveniente da própria indústria sucroalcooleira. No entanto, é de extrema necessidade o desenvolvimento de leveduras capazes de resistir as diversas condições inibitórias provenientes do novo substrato, as quais são potencializadas pelo reciclo celular. Neste sentido, o presente trabalho objetivou o desenvolvimento de novas linhagens de leveduras através das técnicas de hibridação e evolução adaptativa/seleção. Para isto, foi realizado o cruzamento massal envolvendo 5 linhagens de Saccharomyces cerevisiae, previamente selecionadas por demonstrar alta tolerância em fermentações em mosto misto a base de hidrolisado lignocelulósico e melaço de cana-de-açúcar. Inicialmente estudos foram realizados com a intenção de se obter altas taxas de esporulação, a fim de se propiciar uma grande quantidade de cruzamentos aleatórios para consequente geração de uma ampla biodiversidade, aumentando assim a possibilidade de se obter indivíduos com fenótipos melhorados. A cultura resultante do cruzamento massal foi seguida de evolução adaptativa/seleção, buscando, após cerca de 51 gerações, um enriquecimento da cultura com as linhagens mais tolerantes. Por meio de avaliação de crescimento em microplacas (DO 600nm), foram selecionadas 10 isolados evoluídos, os quais foram submetidos a ensaio de fermentação em bancada, simulando tanto quanto possível as condições industriais. Ao final, foi possível destacar uma linhagem por apresentar teor de reserva de trealose significativamente maior que as demais linhagens avaliadas, demonstrando assim a geração de um fenótipo melhorado. / Searching for renewable energy sources to substitute the fossil fuels use is growing, due to a great concern worldwide for global warming and climate change. Brazil is considered the holder of the most economically viable process of ethanol production. Estimates indicate that ethanol production of first generation will not be enough to supply future global demand for biofuel. Therefore, an ethanol production from the lignocellulosic biomass show up as a potential solution; however, during biomass pretreatment and hydrolysis, several toxic compounds such as furfural, HMF, weak acid, and phenolic compounds are formed, which exert inhibitory effects on yeasts, resulting in a fermentative yield decrease. Besides the technological advantages, presents in Brazilian industrial processes to incorporation of 2G ethanol production in existing factories, add up the abundance of feedstock comes from the own sugar and alcohol industry. However, the development of yeasts strains, resisting to inhibitory conditions from the new substrate which are potentiated by the cellular recycle, is extremely necessary. In this sense, the present work aimed the development of new yeasts strains by hybridization and adaptive evolution techniques. Mass mating was carried out involving 5 strains of Saccharomyces cerevisiae, previously selected by demonstrating high tolerance to fermentation from mixed-must composed by lignocellulosic hydrolyzate and sugarcane molasses. Previous studies were carried out to get high rates of sporulation that promote random crosses and broad biodiversity, in order to obtain individuals with improved phenotypes. The culture resulting from the mass mating was followed by an adaptation/selection, during 51 generations, generating enrichment of more tolerant strains. By means of microplate growth evaluation (DO 600nm), 10 evoluted isolates were selected, which were submitted to lab scale fermentation, simulating as much as possible as industrial conditions. At the end, it was possible to highlight a lineage demonstrating significantly higher trehalose reserve content than the other lineages evaluated, thus demonstrating a generation of an improved phenotype.

A casca de coco verde (Cocos Nucifera L.) é um resíduo lignocelulósico amplamente disponível na região Nordeste do Brasil e de grande preocupação ambiental devido ao seu volume elevado. Mas, os materiais lignocelulósicos podem ser recursos renováveis e abundantes para obtenção de açúcares após passarem por hidrólise enzimática da celulose e hemicelulose. Para uma eficiente hidrólise é necessário romper a rede lignocelulósica que circunda fisicamente as fibras de celulose dificultando contato entre celulose e enzima. Os tratamentos tradicionais de deslignificação que empregam condições drásticas de temperatura e pH levam à formação de alguns compostos que limitam o uso desses hidrolisados em processos biotecnológios pois inibem a ação microbiana. O tratamento com CO2 supercrítico pode ser operado em condições amenas de pH e temperatura evitando o problema da formação destes inibidores. Portanto, o objetivo geral desse trabalho foi a obtenção de açúcares redutores a partir da fibra da casca do coco verde por meio de hidrólise enzimática da fibra prétratada com CO2 em condições supercríticas. Foram estudadas sete condições de extração em que se variou o tempo de contato do CO2 com a fibra de coco (3 e 5 horas), modificador de polaridade (NaOH, NaHSO4 e etanol) e manteve-se constante a extração dinâmica por 1 hora seguida de despressurização rápida no final do processo. A eficiência da extração com CO2 supercrítico para deslignificação da fibra de coco verde foi baseada na caracterização da fibra pela composição lignocelulósica, imagens de microscopia eletrônica de varredura e análise qualitativa da composição lignocelulósica por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier e a quantificação de açúcares redutores. A fibra de coco apresentou teores de lignina, celulose e hemicelulose de 26,66, 46,37 e 16,18 g/100g de fibra de coco verde seca, respectivamente. Para hidrólise enzimática utilizou-se uma enzima comercial composta de três enzimas principais: celulases, hemicelulases e β-glucosidases em dois tempos de hidrólise (24 e 72 h) e duas concentrações enzimáticas (6 e 30g de enzima/g de celulose total no substrato) para que fossem avaliadas as situações de aplicação comercial e condições de rendimento máximo. O tratamento com CO2 supercrítico provocou alterações na estrutura física e química da fibra, aumentando a porosidade e diminuindo o teor de compostos fenólicos e ceras e também afrouxamento das ligações de hidrogênio caracterizando a deslignificação da fibra de coco verde. No entanto, a extração com CO2 supercrítico não causou aumento significativo da obtenção de açúcares redutores após hidrólise enzimática da fibra de coco. A hidrólise enzimática realizada em 72h gerou aumento em até 134% no teor de açúcares redutores em relação a hidrólise com 24h de reação para a mesma concentração enzimática (30%). A hidrólise enzimática (72h e 30% de enzima) da fibra de coco verde in natura apresentou bons valores de açúcares redutores (532,27 µmol de glicose/g de fibra de coco seca), podendo ser uma nova utilização para o material lignocelulósico do coco verde que é subaproveitado. Os açúcares redutores obtidos da fibra de coco verde in natura podem passar por processo de purificação e isolamento de algum açúcar de interesse econômico ou ser utilizado em processos que açúcares redutores são necessários como substrato para fermentação por Saccharomyces cerevisiae na produção de álcool, por exemplo. / The coconut husk (Cocos nucifera L.) is a lignocellulosic byproduct widely available in the Brazilian Northeast region and due its high volume is a reason of huge environmental concern. But the lignocellulosic materials are renewable and abundant resources of sugars after submitted to enzymatic hydrolysis of cellulose and hemicellulose. For efficient hydrolysis is necessary to break the lignocellulosic netting that physically surrounds the cellulose fibers hindering contact between the enzyme and cellulose. The traditional delignification treatment employing drastic conditions of temperature and pH lead to the formation and release of some compounds that limit the hydrolysates use in biotechnological processes since it inhibits microbial action. The treatment with supercritical CO2 can be operated at lower temperatures avoiding inhibitors formation. Therefore, the aim of this study was to obtain reducing sugars from the husk coconut fiber through enzymatic hydrolysis of pretreated fiber with CO2 in supercritical conditions. Seven extraction conditions were studied varying the CO2 contact time with the coconut fiber (3 and 5 hours), polarity modifier (NaOH, NaHSO4 and ethanol) and maintaining as constants the dynamic extraction time (1 hour) and rapid depressurization at the end of process. The efficiency of extraction with supercritical CO2 to green coconut fiber delignification was based on the characterization of the fiber by the lignocellulosic composition, images of scanning electron microscopy and qualitative analysis of lignocellulosic composition spectroscopy infrared with Fourier transform and quantification of reducing sugars. Green coconut fiber presents lignin, cellulose and hemicellulose contents of 26.66, 46.37 and 16.18 g/100 g of dry coconut fiber, respectively. For enzymatic hydrolysis used a commercial enzyme composed of three major enzymes: cellulase, hemicellulase and β-glucosidases in two hydrolysis time (24 h and 72) and two enzymatic concentrations (6 and 30 g enzyme / g cellulose in total substrate) to be evaluated situations of commercial application and conditions de maximum yield. Treatment with supercritical CO2 caused changes in the physical and chemical structure of the fiber, increasing the porosity and decreasing the level of phenolic compounds, waxes and hydrogen bonds attenuation causing the delignification of coconut fiber. However, extraction with supercritical CO2 didn\'t significant increase reducing sugars fiber contents after enzymatic hydrolysis. Enzymatic hydrolysis performed in 72h caused up to 134% increase in reducing sugars compared to smaller hydrolysis time (24) for enzyme concentration of 30%. In general, enzymatic hydrolysis (72 hours and 30% of enzyme) of natural coconut fiber showed good values of reducing sugars (532,27 µmol glucose/g de dry coconut fiber) and may be used as a new lignocellulosic material from coconut which is underused. Reducing sugars obtained from natural coconut fiber can pass through purification process of purification of some sugar of interest economic or be used in processes that reducing sugars are necessary as a substrate for fermentation by Saccharomyces cerevisiae, as example in alcohol production.