Devido as suas características funcionais, as proteínas vêm sendo cada vez mais utilizadas em diferentes áreas e atividades da sociedade humana como: alimentícia, indústria, têxtil, papel e celulose, química e médica. A produção industrial de proteínas de valor comercial para diversas aplicações, vem sendo cada vez mais conduzida através do desenvolvimento de sistemas de expressão em diferentes hospedeiros, como Saccharomyces cerevisiae. O presente trabalho teve por objetivo desenhar um sistema de expressão metabolicamente independente induzido pelo hormônio estradiol que, em S. cerevisiae, seja capaz de produzir e secretar com eficiência proteínas homólogas e/ou heterólogas de interesse industrial. Para tanto, foi desenhado e construído um plasmídeo regulador (que expressa o fator de transcrição quimérico c-mycGal4(DBD)hERα(LBD)VP16(AD) e um plasmídeo de expressão (que contém o promotor quimérico p5xUASGAL-UARcb1, o qual será induzido pelo fator de transcrição quimérico, regulando a expressão da proteína repórter celobiohidrolase I - cbh1 de Trichoderma reesei). Ambos plasmídeos foram utilizados para transformar a cepa ScW303-1A/pdr5Δ(construída neste trabalho) e induzido com diferentes concentrações de estradiol. Para analisar a habilidade do promotor em dirigir a expressão da proteína repórter cbh1, foi feito o teste de DNS, com os transformantes selecionados, utilizando carboximetilcelulose 1% como substrato. A maior atividade enzimática ocorre na indução do sistema com 5 μM de 17-β-estradiol e DES (dietilestilbestrol). Os resultados mostram que o sistema de expressão induzido por 17-β-estradiol e DES, funciona de forma eficiente em S. cerevisiae e que o mesmo pode ser utilizado na produção biotecnológica de outras proteínas de interesse. / Due to its functional characteristics, the proteins are being increasingly used in different areas and activities of human society: food, industry, textile, pulp and paper, chemical and medical. The industrial production of commercially valuable proteins for various applications is increasingly being conducted through the development of systems of expression in different hosts such as Saccharomyces cerevisiae. This study aimed to design a metabolically independent expression system induced by estradiol hormone in S. cerevisiae is able to produce and secrete effectively homologous proteins and / or heterologous of industrial interest. Thus, it was designed and built a regulatory plasmid (expressing the chimeric transcription factor c-myc-Gal4 (DBD) -hERα (LBD) - VP16 (AD) and an expression plasmid (which contains the chimeric promoter 5xUASGAL- UARcb1, which is induced by the chimeric transcription factor, regulating the expression of the reporter protein cellobiohydrolase I - cbh1 of Trichoderma reesei). Both plasmids were used to transform ScW303-1A / pdr5Δ strain (constructed in this work) and induced with different concentrations of estradiol. To analyze the ability of the promoter to direct the expression of the reporter protein cbh1, the DNS testing, with the selected transformants was done using 1% carboxymethylcellulose as a substrate. The highest enzymatic activity occurs in the induction system with 5 μM of 17-β-estradiol and DES (diethylstilbestrol). The results show that the expression system induced by 17-β-estradiol and DES operates efficiently in S. cerevisiae and that it can be used for the biotechnological production of other proteins of interest.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-23082016-091835 |
| Date | 03 May 2016 |
| Creators | Adriani, Patricia Pereira |
| Contributors | Alcalde, Felipe Santiago Chambergo |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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