A Dissulfeto Isomerase Proteica (PDI) é uma chaperona ditiol-dissulfeto oxidoredutase da superfamília tiorredoxina que catalisa o enovelamento de proteínas secretadas ou de membrana por meio da introdução, redução ou isomerização de pontes dissulfeto. A PDI é primariamente localizada no lúmen do retículo endoplasmático, no entanto a presença de uma pequena fração da PDI na superfície celular e no meio extracelular tem sido documentada em diversos tipos celulares. Particularmente em plaquetas e células endoteliais, a PDI epi/pericelular (pecPDI) está envolvida em diversos processos incluindo ativação de plaquetas/trombose, infecções virais e remodelamento vascular. A ausência de PDI (e outras tiol isomerases) na circulação tem sido proposta como mecanismo para prevenir trombose na ausência de lesão vascular. No entanto, esta questão permanece obscura e existe pouca informação sobre a concentração circulante da PDI e outras tiol isomerases vasculares. Neste estudo, investigamos a ocorrência e implicações fisiológicas de um pool circulante de PDI em indivíduos saudáveis e validamos um ensaio para detecção da PDI. Os resultados mostraram um pool detectável de PDI no plasma por ELISA, confirmados por imunoprecipitação e ensaio de atividade (inibição da redução da sonda di-eosina-GSSG pela rutina, um inibidor específico da PDI). A concentração de PDI no plasma (mediana=330 pg/mL) indicam uma alta variabibilidade interindividual, com valores muito baixos/indetectáveis (plasmas pobres em PDI [PP-PDI], definidos como <= 330 pg/mL) até valores superiores a 1000 pg/mL (plasmas ricos em PDI [PR-PDI], designados como > 330 pg/mL). Por outro lado, um resultado importante foi o fato de que valores de PDI mostraram variabilidade intraindividual muito baixa ao longo do tempo, detectada através de medidas repetidas em diferentes ocasiões e/ou condições. A fração de PDI presente em micropartículas plasmáticas foi variável, mas em geral pequena em relação ao pool total de PDI. O pool da PDI no plasma está majoritariamente reduzido (60-80%) sem diferenças entre os grupos PP-PDI e PR-PDI. Importante, os valores de PDI associaram-se a distintos perfis proteômicos plasmáticos. Enquanto os PR-PDI se associaram preferencialmente a proteínas relacionadas a diferenciação celular, processamento de proteínas, funções housekeepings, entre outras, os PP-PDI mostraram expressão diferencial de proteínas associadas a coagulação, respostas inflamatórias e imunoativação. A atividade de plaquetas medida por agregação foi semelhante entre os indivíduos com PP-PDI vs. PR-PDI. No entanto, a PDI solúvel foi diminuída após agregação plaquetária na maioria dos indivíduos em ambos os grupos, sugerindo captura devida a exposição de moléculas adesivas. Em outras séries de experimentos, mostramos que tais perfis proteômicos plasmáticos se correlacionaram ao fenótipo e função endotelial. Células endoteliais em cultura incubadas com PP-PDI ou PR-PDI recapitularam padrões de expressão gênica e de secreção de proteínas similares aos perfis plasmáticos correspondentes. Além disso, as assinaturas proteômicas identificadas em ambos os tipos de plasma traduziram-se em distintas respostas funcionais endoteliais. Os PP-PDI promoveram comprometimento da adesão de células endoteliais à fibronectina e perturbaram o padrão de migração celular associado à reparação de lesão endotelial. Em contraste, os PR-PDI não afetaram significativamente a adesão celular e sustentaram um padrão de migração organizado. Em outra população de pacientes com eventos cardiovasculares, os valores de PDI no plasma (mediana= 35 pg/mL) foram significativamente inferiores aos de indivíduos saudáveis. Em conclusão, o pool detectável de PDI presente no plasma se associou a distintos perfis proteômicos e parece se comportar como um indicador/ marcador de assinaturas proteômicas relacionadas à função e sinalização endotelial. Este é o primeiro estudo descrevendo valores circulantes de PDI diretamente relacionados a distintos fenótipos endoteliais / Protein disulfide isomerase (PDI) is a dithiol-disulfide oxidoreductase chaperone from thioredoxin superfamily which catalyzes introduction, reduction or isomerization of disulfide bonds in nascent proteins, typically destined to extracellular secretion or membrane insertion. PDI is primarily located into the endoplasmic reticulum; however, there are clear evidences for the presence of a small PDI fraction at the cell surface and extracellular milieu in several cell types. Particularly in platelets and endothelial cells, such peri/epicellular pool of PDIA1 (pecPDI) is involved in distinct processes including platelet activation/thrombosis, viral infection and vascular remodeling. The absence of PDI (and other thiol isomerases) from circulating plasma has been proposed as a mechanism to prevent thrombogenesis in the absence of vascular injury. However, this question remains unclear, as there is little information on the circulating levels of PDI and other vascular thiol isomerases. Here we investigated the occurrence and physiological significance of a circulating pool of PDI in healthy humans. We validated an assay for detecting PDI in plasma of healthy individuals. The results showed a detectable pool of plasma PDI by ELISA, confirmed by immunoprecipitation and activity assay (dieosin-GSSG inhibitable by rutin, a specific PDI inhibitor). PDI levels (median= 330 pg/mL) exhibited high interindividual variability, ranging from undetectable/low (PDI-poor plasma, defined as <= 330 pg/mL) until 1000 pg/mL (PDI-rich plasma, > 330 pg/mL). Remarkably, opposite to interindividual variability, the intra-individual variability was quite low, so that values assessed under distinct conditions over time were close and reproducible. The majority (60-80%) of plasma PDI is in the reduced state, without any difference among individuals with PDIpoor and PDI-rich plasma. Importantly, plasma PDI levels could discriminate between distinct plasma proteome signatures, with PDI-rich plasma differentially expressing proteins related to cell differentiation, protein processing, housekeeping functions and others, while PDI-poor plasma differentially displayed proteins associated with coagulation, inflammatory responses and immunoactivation. Platelet activity assessed by aggregation was similar between PDI-poor vs. PDI-rich plasma. However, soluble PDI was decreased after platelet activation in both groups, suggesting sequestration of plateletderived PDI by its potential substrates. In other set of experiments, we showed that such protein signatures closely correlated with endothelial function and phenotype, since cultured endothelial cells incubated with PDI-poor or PDI-rich plasma recapitulated gene expression and secretome patterns in line with their corresponding plasma signatures. Furthermore, such signatures translated into functional responses, with PDI-poor plasma promoting impairment of endothelial adhesion to fibronectin and a disturbed pattern of wound-associated migration and recovery area. In contrast, PDI-rich plasma did not significantly affect cell adhesion and supported organized endothelial migration. In another dataset, patients with cardiovascular events had lower PDI levels (median= 35 pg/mL) vs. healthy individuals. In conclusion, a PDI pool detectable in plasma from healthy individuals is associated with distinct proteomic profiles and seems to behave as an indicator/marker of proteomic signatures related with endothelial function and signaling. This is the first study describing PDI levels as reporters of specific plasma proteome signatures directly promoting contrasting endothelial phenotypes and functional responses
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-22082019-112203 |
| Date | 05 June 2019 |
| Creators | Oliveira, Percíllia Victória Santos de |
| Contributors | Laurindo, Francisco Rafael Martins |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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