La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es una enfermedad neuromuscular que se debe auna expansión de repeticiones CTG inestables en la región 3' no traducida del genproteína kinasa de la DM (DMPK). La DM1 se caracteriza por la miotonía y distrofiamuscular que muestran los pacientes, los cuales también presentan cataratas,arritmias cardiacas y alteraciones neuropatológicas. A nivel bioquímico muestrandefectos en el procesado alternativo de pre-mRNAs específicos lo cual explica algunossíntomas definitorios de la DM1. El mecanismo de patogénesis se debe a la toxicidadde los RNAs con expansiones CUG para la célula. Varias proteínas de unión a RNA,como las proteínas humanas Muscleblind-like MBNL1-3 son secuestradas por lostranscritos mutantes DMPK. Las proteínas MBNL colocalizan con los foci ribonuclearesCUG dentro de los núcleos de músculo y neuronas de pacientes DM1. Existendefectos asociados a DM1 en ratones knockout para Mbnl1 y en moscas mutantesmuscleblind. Nos propusimos generar un modelo en Drosophila de la DM1 paraentender su mecanismo molecular y celular. En primer lugar comprobamos que lasproteínas Muscleblind de Drosophila y la humana MBNL1 eran homólogos funcionales.Un modelo basado en secuestrar la proteína Muscleblind endógena con RNAsportadores de repeticiones CUG sólo sería relevante desde el punto de vistabiomédico si la proteína de Drosophila y la humana realizan funciones equivalentes.Una vez demostrada la conservación funcional entre ambas proteínas mediante elrescate del fenotipo mutante muscleblind expresando la proteína humana, generamosmoscas transgénicas capaces de expresar 60 y 480 repeticiones CUG en un transcritono codificante bajo el control del sistema GAL4/UAS. Detectamos que los RNAs de480 repeticiones CUG formaban inclusiones nucleares y que Muscleblind erasecuestrada por estos transcritos tal y como ocurre en pacientes DM1. La expresiónde RNAs (CUG)480 en músculo mostró una reducción dependiente de la edad en eltamaño de la fibra de los músculos indirectos del vuelo y un aumento en el número devacuolas. Analizamos el patrón de procesado de la α-actinina, un gen muscular, enmoscas que expresan RNAs (CUG)480 y se observó una alteración en los niveles deisoformas. En pacientes también se ha descrito una degeneración en las células de laretina y una pérdida en las neuronas fotorreceptoras. Analizamos la retina de lasmoscas modelo que expresaban RNAs (CUG)480 en el disco de ojo-antena y mostraronalteraciones en la adhesión de las células subretinales y la falta de los rabdómeros delos fotorreceptores. Externamente mostraban un fenotipo de ojo rugoso y ligeramentemás pequeño que utilizamos para comprobar mediante una combinación alélica depérdida de función de muscleblind que las repeticiones CUG estaban interfiriendogenéticamente con la función de este gen. Realizamos una búsqueda demodificadores dominantes con este fenotipo ojo rugoso para identificar genespotencialmente relacionados con el mecanismo de patogénesis de la enfermedad.Identificamos los genes viking y thread entre otros como modificadores y losagrupamos en cinco categorías en función del proceso celular en el que estuvieranactuando; factores de transcripción reguladores, reguladores de la estructura de lacromatina, adhesión celular, apoptosis y metabolismo del RNA. Finalmentecomprobamos in vivo si los RNAs CUG podían ser una fuente de siRNA o miRNAs. Laexpresión de estos RNAs de doble cadena incrementaron los niveles de transcritos demuscleblind por un mecanismo desconocido. En resumen, hemos demostrado queestas moscas reproducen aspectos de la enfermedad humana DM1 y puedenutilizarse para el estudio de la misma. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a neuromuscular disease involving the expansionof unstable CTG repeats in the 3´ untranslated region of the DM protein kinase (DMPK)gene. DM1 is multisystemic and characteristic features include myotonia, musculardystrophy, cardiac arrhythmias, and neuropathology. A biochemical hallmark of DM1 ismisregulated alternative splicing of specific skeletal muscle, heart and brain premRNAs.In mice, expression of 250 CUG repeats within a heterologous RNA gives riseto DM1-like phenotypes demonstrating that expanded CUG repeat transcripts are toxicto cells. RNA binding proteins, most notably human Muscleblind-like proteins MBNL1-3are sequestered by mutant DMPK transcripts. MBNL proteins co-localize with CUGribonuclear foci within muscle and neuron nuclei in DM1 patients. DM1-associateddefects are remarkably similar to those observed in Mbnl1 knockout mice andmuscleblind mutations in Drosophila provide additional examples of DM1-likealterations. To understand this toxic RNA gain-of-function mechanism we developed aDrosophila model expressing 60 and 480 CUG repeats in the context of a nontranslatableRNA. Previously, we showed that MBNL1 rescues a muscleblind loss-offunctionphenotype, thus demonstrating functional conservation. CUG-expressing fliesreproduced aspects of the DM1 pathology, including nuclear accumulation of CUGtranscripts, dystrophic muscles that degenerate with age, splicing misregulation, andreduced Muscleblind activity (evident from the enhancement of CUG-inducedphenotypes by a decrease in muscleblind dose). Targeted expression of CUG repeatsto the developing eye was toxic originating eyes externally rough and smaller thannormal. This phenotype was utilized to identify 15 genetic modifiers. These includedviking and thread, which suggest cellular processes previously unknown to be alteredby CUG repeat RNA such as cell adhesion, programmed cell death, nuclear-cytoplasmexport complex ECJ, and chromatin remodelling. We also explored the possibility thatCUG repeat RNA could be a source of small interfering RNAs, thus silencingtranscripts containing complementary sequences such as muscleblind transcriptthemselves. Surprisingly, we detected an increase of muscleblind mRNA in CUGexpressingflies. To sum up, here we describe Drosophila flies that reproduce aspectsof the human disease DM1 and that can find application in the study of DM1.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UV/oai:www.tdx.cat:10803/9932 |
| Date | 08 June 2007 |
| Creators | Monferrer Sales, Lidón |
| Contributors | Artero Allepuz, Rubén D., Universitat de València. Departament de Genètica |
| Publisher | Universitat de València |
| Source Sets | Universitat de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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