Candida albicans es el principal hongo patógeno en el ser humano, principalmente en pacientes en los que su sistema inmunitario está comprometido. En la actualidad la candidiasis invasiva es la causa más común de infecciones nosocomiales, asociada a una mortalidad del 40%. C. albicans es un hongo polimórfico que presenta la facultad de crecer como levadura, hifa y pseudohifa.Uno de los aspectos por los que C. albicans puede comportarse como comensal o como agente patógeno es su capacidad para responder a los cambios del medio ambiente. Para comprender los mecanismos de adaptación en hongos patógenos a los cambios ambientales continuos dentro del ser humano, es especialmente importante que factores transcripcionales y/o mediadores estén implicados.Mediante un análisis in silico del genoma de C. albicans, se han detectado 70 teóricos factores transcripcionales de la familia Zn(II)2Cys6. Uno de ellos, IPF3781 (a partir de aquí Cwt1), se eligió para su estudio dada la elevada homología que presenta con el factor de transcripción Rds2 de Saccharomyces cerevisiae. Con el objeto de analizar la posible implicación de CWT1 en la biología de C. albicans, se construyó el mutante nulo para este gen. El análisis fenotípico del mutante nulo cwt1/cwt1 indica que Cwt1 está implicado diferentes procesos celulares como son: (i) la arquitectura de la pared celular de C. albicans; (ii) la resistencia a drogas; (iii) la morfogénesis de esta especie celular, sobre todo en medios sólidos; (iv) el metabolismo de azúcares; y (v) la biogénesis de ribosomas. Adicionalmente a los estudios sobre pared celular realizados, se ha estudiado la expresión y regulación, mediante micromatrices de ADN, de diferentes genes en las fases exponencial y estacionaria de la curva de crecimiento con el fin de poder elucidar más feacientemente el papel de Cwt1. Un total de 460 genes en fase exponencial y 666 genes en fase estacionaria tenían alterada su expresión, de los que 121 genes eran comunes a ambas fases de crecimiento de la levadura. Este distinto perfil transcripcional podría explicar el pleiotropismo encontrado en el mutante nulo cwt1/cwt1 respecto al comportamiento de la cepa parental CWT1/CWT1, tanto en fase exponencial como en fase estacionaria de crecimiento. El estudio in silico de las regiones promotoras de los genes cuya expresión estaba alterada indica que las secuencia AGGGCT/AGCCCT podría ser la secuencia de reconocimiento de ADN de Cwt1 para la unión a sus genes diana . Además, estudios de patogenicidad en modelo murino han mostrado que células de las cepas parental y mutante nulo son igual de invasivas ya que penetran al mismo nivel en los órganos de los ratones infectados. Sin embargo, el mutante nulo en el gen CWT1 es totalmente avirulento, indicando que Cwt1 está de algún modo regulando la patogenicidad de C. albicans. Cabe señalar que gran parte del estudio realizado versa sobre la pared celular, dada la importancia que esta estructura tiene en los primeros pasos de una infección, así como para el diseño de nuevos fármacos antifúngicos. No obstante, se puede concluir que Cwt1 actúa como un regulador global de la transcripción, ya que modula la expresión de genes implicados en distintas funciones celulares, ya sea de manera directa o indirecta. / Candida albicans is the most common human fungal pathogen in humans, mainly in immunocompromised patients. Nowadays, the systemic candidiasis is the most common cause of nosocomial infections, with a 40% of mortality associated. C. albicans is a polymorphic fungus that presents the ability to grow in different cellular morphologies such as: yeast, hyphae and pseudohyphae.The ability of these cells to respond to environmental changes within the human body determines their behaviour as commensals or pathogens. The study of those transcriptional regulators that mediate the responses to these environmental changes in pathogenic fungi is very important.After screening a C. albicans genome database, seventy putative transcriptional factors, matching the Zn(II)2Cys6 motif were found. From those, Cwt1p (IPF3781, orf 19.5849) that presented a high homology with Rds2 from Saccharomyces cerevisiae was selected for further studies. To know the possible role of Cwt1p, the disruption of the coding region was performed and the phenotypes of the heterozygous (CWT1/cwt1) and homozygous (cwt1/cwt1) mutants were studied.Phenotypic analysis shows that Cwt1p is involved in the cell wall architecture and morphogenesis in solid media. Since CWT1 is mainly expressed in the stationary phase of growth, the different assays were performed in both exponential and stationary cells.Using murine models, we have established that the deletion of the two alleles of CWT1 does not attenuate the virulence; however, deletion of only one allele completely attenuates virulence.In order to elucidate the role of CWT1 in cell wall formation and pathogenesis, transcription profiling studies were carried out and data comparison between parental and mutant strains (hetero and homozygous mutants) were achieved in both exponential and stationary phases of growth.

A la hora de evaluar el riesgo potencial de compuestos con capacidad tóxica sobre las poblaciones expuestas, resulta de gran importancia considerar la exposición de varias generaciones de organismos al efecto de dichos compuestos. Por ello, en este estudio, se propone la incorporación de un esquema multigeneracional para evaluar la toxicidad de concentraciones subletales del insecticida diazinón y el herbicida molinato en el crustáceo D. magna.Este cladócero, perteneciente al zooplancton filtrador de las aguas dulces asociadas a la región templada del globo, presenta una gran sensibilidad a una amplia gama de compuestos químicos, lo cual, junto con el hecho de disponer de él con facilidad y rapidez gracias a su reproducción partenogenética, ha favorecido su consideración como organismo diana en los ensayos de toxicidad.En el presente trabajo se ha ensayado el efecto de los dos plaguicidas seleccionados sobre la supervivencia, capacidad reproductiva y tamaño corporal de los dáfnidos expuestos. Para ello se realizaron ensayos crónicos de 21 días de duración, exponiéndose varias generaciones de organismos a los plaguicidas seleccionados: una generación parental (F0) y una filial, a través de la primera y tercera camadas de descendientes (F1-1ª y 3ª). Los ensayos crónicos comprendieron una primera fase de exposición a los compuestos ensayados y una segunda fase de recuperación de los descendientes al efecto de los mismos.Además se evaluó el efecto sobre el peso de F0, y sobre el contenido proteico y la actividad acetilcolinesterasa (AChE) de D. magna a nivel multigeneracional en ensayos de 120 horas de duración, registrándose las variaciones en estos parámetros a las 0, 24, 48, 72, 96 y 120 horas de iniciarse el proceso de exposición a los plaguicidas.Los resultados de los ensayos crónicos de toxicidad mostraron una mayor sensibilidad de los descendientes de D. magna expuestos a diazinón y molinato en relación a la de los parentales, siendo mayor el efecto producido por el insecticida. Según estos datos se pensó inicialmente en una posible transferencia de los tóxicos ensayados de la generación F0 a las sucesivas de descendientes. Sin embargo, tras un periodo de recuperación en medio exento de plaguicidas, los descendientes de D. magna registraron valores similares a los valores control para casi todos los parámetros estudiados, observándose una mayor recuperación de la tercera camada.Ambos plaguicidas provocaron un descenso del contenido proteico de D. magna, siendo más acusado el efecto tras la exposición al herbicida, probablemente debido al efecto que éste produjo en la calidad del alga utilizada como alimento de los dáfnidos.Se registró una reducción del peso de los parentales de D. magna tras exposición a diazinón y molinato lo cual se relacionó positivamente con el efecto observado a nivel de la capacidad reproductiva.Ambos plaguicidas inhibieron la actividad AChE de D. magna en todas las generaciones estudiadas, siendo el efecto más acusado (en ambos casos) en la generación parental que en los descendientes, y mayor la inhibición tras exposición a diazinón puesto que es un compuesto diseñado con carácter insecticida.En los descendientes de D. magna expuestos a ambos plaguicidas, al aumentar la concentración del contaminante disminuyó en mayor medida el contenido proteico que la actividad AChE, lo que resultó en algunos casos, en un incremento de la actividad AChE expresada por g de proteína. Tras observar la interferencia del contenido proteico en la expresión de la actividad AChE en D. magna, se recomienda la expresión de esta actividad enzimática por individuo, considerando, al menos, un estudio paralelo del efecto de un compuesto sobre ambos parámetros tratándose de determinaciones efectuadas sobre la totalidad de los organismos expuestos, a diferencia de las evaluaciones efectuadas en vertebrados. / In the present study, a multigenerational chronic toxicity study is proposed in the cladoceran D. magna. The effect of sublethal concentrations of the insecticida diazinon and the herbicide molinate were evaluated in the daphnids.Parental generation (F0) and neonates from the first and third brood (F1-1st and F1-3rd, respectively) were exposed during 21 days to both pesticides, and offspring was also transfered to toxicant free medium (21 days assays) to evaluate its ability to recover from diazinon and molinate effects.On the other hand, the effect of these pesticides were evaluated during 5 days on the acetylcholinesterase (AChE) activity and protein content of all daphnid generations used in this study. Paralelly, weight changes were also evaluated in the parental daphnids (F0).The chronic multigenerational study showed that daphnids from the F1-1st and F1-3rd broods seem not to be adapted to the pesticides and they exhibited more mortality and less reproduction than F0. However, after the recovery period, offspring of D. magna pre-exposed to both pesticides was able to recover the values of the studied parameters and the third brood was the most recovered group. Diazinon effects were higher than those of the herbicide molinate in this 21 day study.Daphnids protein content decreased after exposure to both pesticides, and the effect of molinate was higher. Because molinate is an herbicide the nutritive quality of the algal food of D. magna will be affected.The decreased found in parentals weight after exposure to both pesticides was related to the effect on their reproductive ability.Finally, AChE activity was more inhibited on offspring daphnids exposed to both pesticides compared to the parentals. However, diazinon exposure showed a higher effect in this parameter than molinate because it produces a non reversible inhibition on this enzimatic activity. It was observed an interference of the protein content on the AChE activity expression, so we suggest the calculation of the AChE activity by organism nor by protein content. This suggestion could be important in those studies with small invertebrates where the AChE activity is determinated in the whole organism.

Los alimentos formulados para el cultivo intensivo de peces carnívoros contienen, generalmente, un 40-50% de proteína que está normalmente proporcionada por las harinas de pescado. Sin embargo, mientras que la producción anual de harinas de pescado está estabilizada alrededor de 6-7 millones de toneladas, la acuicultura se expande a una tasa del 11% anual existiendo, de este modo, una seria preocupación acerca de la disponibilidad de esta fuente de alimento como materia prima en la formulación de dietas para su empleo en dicho sector. Dado que los ingredientes de origen vegetal están facilmente disponibles, en los últimos años han recibido la mayor parte de la atención como posibles sustitutos a las harinas de pescado.Para abordar esta problemática, se diseñaron dietas basadas en harinas de pescado (FM) o en ingredientes vegetales, de manera que sustituyeran las harinas de pescado en un 50% (PP50), 75% (PP75) y 100% (PP100). En todas las dietas el cociente entre aminoácidos esenciales y no esenciales estuvo próximo a 1,1, en base a los resultados obtenidos en una experiencia previa incluida en esta Tesis Doctoral. Juveniles de dorada (Sparus aurata) alimentados con la dieta PP100 exhibieron una pérdida severa de biomasa con respecto a los otros grupos experimentales, debido probablemente a una menor ingesta de alimento. Estos peces también exhibieron una menor retención lipídica así como un marcado efecto hipocolesterolémico. En cuanto al eje somatotrópico, se observó un aumento de los niveles circulantes de hormona de crecimiento (GH) con el mayor aporte de ingredientes vegetales, que estuvo acompañado por un descenso de las tasas de crecimiento, de los niveles circulantes de somatomedinas (IGF-I) y de la expresión hepática del receptor de la GH (GHR) y de IGF-I. Esta situación catabólica evidenció una insensibilización hepática a la acción anabólica de la GH en el grupo PP100. A medio plazo (6 meses) se observó una elevada deposición grasa en el hígado de los peces alimentados con la dieta PP100 así como un elevado número de vacuolas lipídicas en los enterocitos. Los niveles de lisozima en plasma no se vieron alterados por el tratamiento pero el estallido respiratorio en leucocitos aislados del riñón anterior y la actividad mieloperoxidasa en plasma aumentaron significativamente en los grupos PP75 y PP100. La actividad del complemento, por otra parte, aumentó significativamente en el grupo PP50 y disminuyó en los grupos PP75 y PP100. Como conclusión general, y junto con los ensayos de calidad sensorial realizados tras un ciclo completo de engorde (1 año), se determinó que la sustitución de harinas de pescado por ingredientes vegetales (hasta un 75%) es posible en una especie típicamente carnívora como la dorada.La actividad del eje somatotrópico también fue analizada en trucha arco iris (Oncorhynchus mykiss), en una experiencia similar a la anterior. Las tasas de crecimiento y la retención energética disminuyeron en los grupos PP75 y PP100, observándose un aumento progresivo en los niveles circulantes de GH. Sin embargo, no se observaron cambios ni en los niveles circulantes de IGF-I ni en la expresión hepática de GHR e IGF-I. Se encontraron dos bandas específicas de proteínas de unión a la IGF (IGFBPs) en el plasma de todos los peces analizados, aumentando progresivamente su concentración y su grado de glicosilación con el aumento de la cantidad de proteína vegetal de la dieta, lo que podría disminuir la disponibilidad de IGF libre. Así, la disminución del crecimiento pudo estar debido, al menos en parte, a una menor disponibilidad de la forma activa de la IGF (fracción libre) más que a una insensibilización hepática a la GH o a un defecto en la síntesis y liberación de IGF-I. / Aquafeeds for carnivore fish contain a 40-50% of crude protein, which is usually provided byfishmeal. However, while the annual production of fishmeal is stabilized around 6-7 million tonnes,the aquaculture industry expands at a rate of 11% per year. Thus, it exists a great concern about theavailability of these raw materials to formulate aquafeeds for aquaculture. As plant ingredients areeasily available, in the last years a great effort has been done to investigate the possible use of plantingredients to replace fishmeal in aquaculture.To solve this problem, a diet with fish meal as the sole protein source was compared to dietswith 50%, 75% and 100% of replacement in juveniles of gilthead seabream (Sparus aurata). Theindispensable amino acid to dispensable amino acid ratio (IAA/DAA) was close to 1,1 in all diets asit was stablished in the first trial of this study. Growth performance, enzyme activities (amino acidcatabolism and lipogenic pathways) and plasma metabolites (glucose, triglycerides and cholesterol)were measured. The hormone system that regulates fish growth was also study (plasma levels ofgrowth hormone and IGF-I, hepatic expression of GH receptors and IGF-I). We also developedimmuno-histochemical studies and parameters of the inespecific immunological system (plasmalysozyme, respiratory burst activity, plasma myeloperoxidase, complement) were also evaluated. Asa conclusion, substitution of fishmeal by a mixture of plant protein sources compromised growthperformance only at the 100% level, and decreased one of the immune defence mechanisms atabove 75% level. The quality of the fillet in fish fed diet PP75 until they reached market size wasnot affected by dietary treatment which means that up to 50-75% of fishmeal replacement seems tobe feasible with IAA supplementation in a fish species having high dietary protein requirements.The activity of somatotropic axis was analysed in juveniles of rainbow trout (Oncorhynchusmykiss) in a similar growth trial. It is shown that a different regulation of this hormonal system isfound in response to a partial or total replacement of fishmeal by plant ingredients compared togilthead seabream.

La regulación y control del uso del agua y la mejora de la calidad merece especialatención debido a la contaminación provocada por los vertidos de origen agrícola,industrial y urbano. Para ello es necesario una correcta valoración de los efectos de loscontaminantes sobre el medio acuático. Existen indicadores basados en cambiosfisiológicos y bioquímicos (biomarcadores) de los organismos acuáticos, cuyas ventajasson la rapidez de respuesta ante un episodio de contaminación y la especificidadrespecto al contaminante. La metalotioneína (MT) es considerada un biomarcadorespecífico de contaminación por metales. El presente trabajo se centra en diferentesaspectos relacionados con la viabilidad de la utilización de la MT como biomarcador enel seguimiento de los efectos de la contaminación por metales en aguas epicontinentalescontrastando diferentes métodos de determinación. Se realizó un estudio de campo endiferentes tramos del río Ebro utilizando carpas, Cyprinus carpio, y barbos, Barbusgraellsii, como animales centinela. Esta zona recibe el impacto de vertidos tantourbanos como industriales. Se encontró una elevada concentración de cadmio ymercurio en el hígado de las carpas y barbos capturados en Flix y Monzón, indicando laexistencia de contaminación por metales en las estaciones mencionadas. Lasconcentraciones de metalotioneína determinadas en el hígado de ambas especies noreflejan la contaminación por metales, lo que limita el potencial de la MT comobiomarcador en este tejido.El parque Natural de la Albufera es una zona sometida a diversos impactosambientales. La anguila europea, Anguilla anguilla, es una de las especies másrepresentativas del lago de la Albufera y su población está en declive. El aumento de laacuicultura intensiva de esta especie y la elevada demanda local de la misma, ocasionaque se comercialicen ejemplares salvajes y cultivados. Se encontraron diferencias tantoen el patrón de distribución como en la concentración de metales en los distintosórganos de las anguilas de ambas procedencias. Las anguilas cultivadas presentaronniveles de cadmio superiores a los encontrados en las anguilas salvajes en todos lostejidos, sin que las concentraciones de este metal en el músculo superaran los nivelesmáximos permitidos por la legislación actual. Las concentraciones de MT fueronsuperiores en el riñón de anguilas cultivadas que en el de las salvajes, existiendo unaalta correlación entre la concentración de MT y la de cadmio. La exposición crónica aplomo produce variaciones en las concentraciones de metalotioneína y de metalesesenciales, así como en la actividad ácido δ-aminolevulínico deshidratasa (ALAD) delos tejidos de anguila, siendo estos efectos especialmente evidentes en el riñón. El riñónde A. anguilla se propone como órgano de elección en los estudios de bioseguimientode contaminación en que se considere la MT o la actividad ALAD como biomarcador.En todas las especies de peces estudiadas existe una alta correlación entre los niveles decobre y metalotioneína hepática, mostrando la importancia de esta proteína en elmetabolismo del cobre en el hígado.La determinación de metalotioneína mediante polarografía de pulso diferencial(PPD) en los tejidos del gasterópodo Melanopsis dufouri presenta como inconvenientela presencia de compuestos termoestables de alto peso molecular que interfieren con ladeterminación. La introducción de la ultrafiltración como un paso adicional en elprocedimiento resultó apropiada para la eliminación de dichos compuestos. Laacumulación lineal de cadmio con el tiempo en M. dufouri, expuesto de forma crónica aconcentraciones realísticas del metal, indica el potencial de esta especie en elbioseguimiento de la contaminación por cadmio. Las propiedades fisicoquímicas de la proteína aislada y purificada en el complejo visceral de M. dufouri confirman que setrata de metalotioneína.Los resultados obtenidos en los diferentes estudios ponen de manifiesto que laviabilidad de la utilización de la metalotioneína como biomarcador de contaminacióndepende en gran medida de la especie y del órgano seleccionado, así como de unametodología adecuada para su determinación. / Biological indicators are frequently used to assess water quality. Metallothioneins(MTs) were considered specific indicators of metal pollution. The present study focuson the MT use in fish and gastropods. Carps (Cyprinus carpio) and barbels (Barbusgraellsii) were collected from the Ebro river that receives a series of discharges ofdifferent origin. The highest mercury and cadmium levels were measured in liver ofcarps collected at Flix. A positive correlation was found between MT and copperconcentrations, but no significant differences among sampling points were found forvalues corresponding to these two parameters. Metallothionein and metal content weredetermined in various organs of commercially available eels (Anguilla anguilla) ofsimilar size obtained from a local farm and from Albufera of Valencia lake (Spain).Farmed fish showed statistically significant higher Cd concentrations in liver andkidney whereas wild individuals had higher levels of Pb in blood. Significant positivecorrelations were found between metallothionein and Cd in kidney of farmed eel. Nostatistically significant differences were found between the two populations in theconcentration of any of the metals analyzed in muscle and, in all instances, these levelswere lower than the limits established by the Spanish legislation for fish destined tohuman consumption. The ALAD activity, levels of MT and metal concentration weremeasured in several tissues of eels exposed to lead. The ALAD activity (liver andkidney) decreased with time of exposure, and hepatic and renal MT levels increasedslightly with lead exposure. Kidney is the most relevant organ for metal pollutionmonitoring in eels when MT or ALAD were used as biomarkers.Previous studies demonstrated that the use of differential pulse polarography for MTdetermination in gastropod tissues requires to take into account the presence of heatstable high molecular weight compounds that exhibits polarographic signal. We havefound that ultrafiltration is an effective way of removing the high molecular weightcompounds after the heating treatment. Accumulation of cadmium was linear with timein the visceral complex. Metallothionein measured in the ultrafiltrated heat-treatedcytosolic fractions from snails exposed to 6 and 100 μg of cadmium for eight weekswere found to be correlated to cadmium accumulation whereas such correlation was notsignificant when the total polarographic response was considered. A fully validatedprocedure for MT determination in Melanopsis dufouri is described.

Comprender el fenómeno de la resistencia a los insecticidas en sus diferentes niveles permite la formulación de las tácticas/estrategias a emplear para un control racional de la resistencia en plagas de insectos y proporciona, además, el conocimiento necesario para incrementar la especificidad y eficacia de los insecticidas, reduciendo así sus efectos perjudiciales. Con este fin, esta Tesis trata de abordar el estudio de los mecanismos implicados en la resistencia a los insecticidas, concretamente los sistemas enzimáticos relacionados con la resistencia metabólica, en los insectos plaga Frankliniella occidentalis y Blattella germanica. Ambas son, respectivamente, ejemplos de plagas de importancia, tanto agrícola como en salud pública, y, al igual que el resto de especies de la clase Insecta, presentan una sorprendente similitud en los mecanismos subyacentes a la resistencia. Así tras el análisis de una población de campo de Blattella germanica, ésta resultó ser altamente resistente al piretroide deltametrina y entre los múltiples mecanismos metabólicos responsables se identificaron a esterasas y P450. La posterior selección en el laboratorio con deltametrina pretendía identificar los mecanismos específicamente relacionados con la resistencia a este insecticida y su contribución en el fenotipo final. Así, tras ser sometida a varios ciclos de selección, la resistencia de la población estudiada creció rápidamente de 1,58x a 102x en tan sólo tres ciclos, sugiriendo la posible selección de mecanismos de carácter recesivo. La supresión incompleta de la resistencia por los sinergistas PBO y DEF, y la resistencia cruzada con otro piretroide (acrinatrina) evidenciaron que, además de oxidasas (principalmente) y esterasas (en menor medida), otros mecanismos de naturaleza no metabólica podrían ser coseleccionados en los individuos resistentes a la deltametrina, posiblemente modificaciones de la diana del tipo kdr. En cuanto a los análisis en muestras de F. occidentalis, en las que se incluyeron tanto poblaciones seleccionadas en laboratorio como las recogidas en invernaderos del sureste español, los datos de toxicidad que indicaban la posible presencia de más de un mecanismo responsable de la resistencia, fueron confirmados con los resultados de los análisis bioquímicos. Dichos análisis mostraron una correlación significativa entre los niveles elevados de la actividad esterasa y la resistencia a la acrinatrina (piretroide) que, sin embargo, no explicaba la resistencia en su totalidad, lo que apoyaría la hipótesis del carácter multifactorial de la resistencia de las poblaciones españolas de Frankliniella analizadas. Los mecanismos de desintoxicación metabólica aquí identificados, tanto en Blattella como en Frankliniella, son específicos de una familia de compuestos químicos, e incluso en ocasiones de un determinado compuesto; por ello, las estrategias de control deberían contemplar en estas especies el empleo rotativo de compuestos químicos de distintas clases. / To understand the phenomenon of insecticide resistance at different levels allows the formulation of the strategies to be used for a rational management of resistance in insect pests and provides, in addition, the knowledge to increase the specificity and effectiveness of insecticides, being reduced this way its detrimental effects. With this aim this Thesis deals to undertake the study of the mechanisms involved in the resistance to insecticides, and concretely the enzymatic systems related to metabolic resistance, in Frankliniella occidentalis and Blattella germanica. Both species are examples of important pests in agriculture and public health respectively, and surprisingly they show similar underlying resistance mechanisms to the rest of the insect species. After the analysis of a field population of Blattella germanica, this one turned out to be highly resistant to the pyrethroid deltamethrin; esterases and P450 were identified among several metabolic mechanisms. Laboratory selection with deltamethrin tried to identify the mechanisms specifically related to the resistance to this insecticide and its contribution to the final phenotype. In this way, after being put under several cycles of selection, the resistance of the studied population quickly grew up from 1,58x to 102x in only three cycles, suggesting the possible selection of mechanisms of recessive nature. The incomplete supression of the resistance by synergists PBO and DEF, and cross-resistance to another pyrethroid (acrinathrin) proved that, in addition to oxidases (mainly) and esterases (to a lesser extent), other mechanisms of non-metabolic nature could be co-selected in the resistant individuals, possibly modifications of the kdr-type. The analyses of F. occidentalis samples showed a significant correlation between the elevated levels of the esterase activity and the resistance to acrinathrin, although, it did not explain the resistance in its totality, which would support the hypothesis of the multifactorial character of the resistance of the spanish field populations of Frankliniella analyzed. The mechanisms identified here, as much in Blattella as in Frankliniella, are specific of a chemical compound family, and even sometimes of composed determining; for that reason, the control strategies would have to contemplate the rotation of different classes.

El trips occidental de las flores, Frankliniella occidentalis (Pergande) (Thysanoptera: Thripidae), es una de las plagas más importantes en los cultivos hortícolas de nuestro país, ya que se trata de uno de los principales vectores en la transmisión del virus del bronceado del tomate. De forma general, los medios químicos son los más ampliamente utilizados en su control, aunque presenta serias dificultades ya que se requieren aplicaciones reiteradas y, además, la gama de materias activas y formulados para el control de esta plaga es bastante reducida. En España se han documentado fallos en su control desde el año 2001, como consecuencia del desarrollo de resistencia a los insecticidas comúnmente empleados. En este contexto, en este trabajo se estudiaron los mecanismos responsables de la resistencia frente a los insecticidas en poblaciones españolas de F. occidentalis. Se evaluaron tanto mecanismos de destoxificación, como modificaciones de los puntos diana. En lo que respecta a los mecanismos de destoxificación se realizó un estudio cualitativo y cuantitativo de la actividad esterasa como posible mecanismo implicado en la resistencia en poblaciones procedentes de diferentes invernaderos comerciales y experimentales. Los resultados obtenidos indicaron que las esterasas se encontraban implicadas en la resistencia a los insecticidas acrinatrina y metiocarb en los estados iniciales de la resistencia. Concretamente, un grupo de tres isoenzimas, con baja movilidad electroforética y elevada intensidad en la tinción, se asoció con la resistencia a estos insecticidas. Además, se determinó que los insectos que presentaban dicho grupo de bandas mostraban, a su vez, una mayor actividad esterasa frente al sustrato -naftil acetato, ratificando la relación entre tales bandas y la resistencia mostrada por los insectos. Por otro lado, se realizó un análisis in vitro e in vivo del efecto producido por diversos compuestos sinergistas sobre la actividad esterasa en poblaciones seleccionadas en el laboratorio, para poder determinar con mayor precisión lo que ocurre en el interior del insecto cuando estos compuestos son aplicados junto con los insecticidas, ya que la especificidad de los sinergistas es relativa y ha de ser estudiada para cada especie. Los resultados de estos estudios indicaron que los tres sinergistas utilizados, DEF, PBO y metiocarb, inhibían la actividad esterasa cuando eran aplicados in vitro, aunque en diferente grado, siendo el PBO considerablemente menos efectivo. Sin embargo, en las condiciones utilizadas en los estudios in vivo, tan solo el DEF resultó ser efectivo, y máxime al cabo de una hora tras su aplicación. Después de los sistemas de destoxificación, la modificación de las dianas es el segundo mecanismo más común como responsable de la resistencia. En este sentido, se llevó a cabo un estudio cualitativo y cuantitativo de la actividad colinesterasa, como posible diana modificada causante de la resistencia. El estudio se realizó en insectos recogidos en campo y seleccionados en laboratorio, ya que en ambos casos se encontraron poblaciones cuya resistencia no podía ser explicada únicamente por efecto de las enzimas de destoxificación. De los resultados obtenidos se cuestiona la presencia de la enzima butirilcolinesterasa en los trips (como se apunta en algunos trabajos) y, por otro lado, se sugiere que una modificación en las acetilcolinesterasas de F. occidentalis podría ser un mecanismo implicado en la resistencia frente al insecticida metiocarb. Del mismo modo, un aumento de la actividad de esta enzima también parecía conferir resistencia, aunque en mucho menor grado. / In this work we have studied the mechanisms responsible for resistance to insecticides in Spanish populations of Frankliniella occidentalis, one of the most important pest in vegetable crops in our country.Regarding to the mechanisms of detoxification, a study of the esterase activity was performed to evaluate its implication in the resistance. Our results indicated that a group of three isoenzymes esterase was involved in the early resistance to acrinathrin and methiocarb insecticides. Moreover, it was found that insects with this group of electrophoretic bands presented increased esterase activity to -naphthyl acetate substrate, suggesting a relationship between such bands and resistance. Furthermore, it was performed an in vitro and in vivo analysis of the effect of various synergist compounds on the esterase activity. The three synergists used, namely DEF, PBO and methiocarb, inhibited the esterase activity when they were applied in vitro; the PBO was the less effective compound. However, only DEF proved to be effective in the in vivo studies, in particular one hour after its application. Besides detoxification systems, target sites modifications are also a common resistance mechanism. In this sense, we performed a qualitative and quantitative study of cholinesterase activity. Our findings questioned the presence of a butirilcholinesterase in thrips (as outlined by some other authors) and, on the other hand, suggested a change in acetylcholinesterase enzyme of F. occidentalis as a mechanism involved in resistance to methiocarb insecticide. Similarly, an increase in the acetylcholinesterase activity also appeared to confer resistance, although to less degree.

En el presente trabajo se han estudiado los posibles efectos que concentracionessubletales de un herbicida de uso común en los arrozales del Parque Natural de laAlbufera, el propanil, pueden tener sobre una especie típica de este ecosistema, laanguila europea, Anguilla anguilla. La anguila se encuentra en fase de crecimiento yengorde durante su permanencia en el Lago, de modo que resulta relevante determinar sila contaminación por estos plaguicidas altera su equilibrio fisiológico, lo que afectaría asu normal crecimiento y desarrollo y que en último término repercutiría negativamenteen funciones vitales como la reproducción y la supervivencia.En primer lugar se procedió a la evaluación de la toxicidad aguda del propanil sobrela citada especie determinando para ello su efecto sobre la mortalidad de los individuos.Posteriormente se realizó un seguimiento de las alteraciones fisiológicas inducidas enesta especie bajo la influencia de dos concentraciones subletales del mismo herbicida,durante una fase de exposición de 72 h de duración, seguida de una fase de recuperaciónen agua exenta de herbicida (144 h) mediante un sistema de flujo continuo decirculación de medio (Flow-through test system). Paralelamente se efectuó unexperimento Control efectuado bajo las mismas condiciones experimentales, aexcepción de la adición del herbicida al medio.Así, se observó una clara respuesta de estrés en la anguila, caracterizada porhiperglucemia, hiperlactemia, hiperlipemia e hipoproteinemia, que se acompañó de unareducción de los niveles de glucógeno, proteínas totales y lípidos en diferentes órganosy tejidos, en los que un aumento de lactato fue también cuantificable como resultado dela situación de hipoxia provocada. Los animales necesitaron movilizar sus reservasenergéticas, como puso de manifiesto el descenso del contenido calórico en órganos dereserva como el hígado y el músculo. El periodo de recuperación estipulado fueinsuficiente para la restauración de los parámetros estudiados una vez eliminado elherbicida del medio, independientemente de la concentración de propanil utilizada.El hígado resultó un órgano muy "extenuado" durante la exposición al propanil,como se deduce del descenso observado de los niveles plasmáticos de albúmina yproteínas totales, junto con el aumento de las actividades enzimáticasAminotransferasas, Fosfatasa alcalina y Lactato deshidrogenasa hepáticas, y el descensode la actividad gamma-Glutamil transferasa hepática, apoyado por el aumento del índicehepatosomático, y del contenido hídrico de este órgano. Este deterioro hepático fue másacusado en los animales expuestos a la concentración de herbicida más alta.Se cuantificó la actividad enzimática Fosfatasa alcalina, que mostró una gransensibilidad a la presencia de propanil en el medio. Su actividad en general aumentó entodos los órganos y tejidos analizados, indicativo de lesiones en los tejidos y necrosiscelular. Su grado de alteración fue mayor con la concentración más elevada de herbiciday su posterior recuperación fue función del tejido u órgano, de la concentración deherbicida y del tiempo de exposición.La función gamma-Glutamil transferasa, indicativa de la activación de rutas dedetoxificación de xenobióticos y de estrés oxidativo, mostró una disminución de suactividad en el hígado paralela a su aumento en el músculo esquelético y el corazón,durante la exposición al tóxico. Tras la transferencia a agua libre de propanil, laactividad se "normalizó" en el corazón; mientras que continuó alterada en el músculo yen el hígado.El periodo de recuperación de seis días fue suficiente para observar la tendencia alrestablecimiento de la mayoría de las actividades enzimáticas medidas en las anguilasexpuestas a la concentración menor de propanil. Sin embargo, en los animalesexpuestos a la concentración más elevada, el periodo de recuperación estipulado (eldoble que el periodo de exposición) no fue suficiente. / Propanil is one of the major herbicides employed on rice farming around the worldbeing widely used in the Albufera Natural Park (Valencia, Spain). Populations ofEuropean eel, Anguilla anguilla, commonly inhabit this protected ecosystem. It isessential to determine whether this herbicide affects the individuals of this species.Alterations in the physiology, biochemistry or even behaviour of fish are beinginvestigated as potential diagnostic tools for assessing environmental effects of thecontaminants. The lethal toxicity (LC50) of propanil in the European eel wasdetermined resulting in 31.55 ppm at 96 hours exposure. In order to investigatesublethal effects of propanil on fish physiology, two sublethal concentrations (1/10 and1/50 LC50-96h) were selected. Eels from Albufera Lake were exposed to 0.63 and 3.16mg/L of propanil for 72 hours in a continuous flow-through system and allowed torecover in propanil-free water for 144 additional hours. Parallel a third group of eelswas kept in clean water as Control experiment. The parameters studied were not alteredduring the control experiment. Propanil induced a stress response in the eels. A increasein glucose, lactate and lipids (cholesterol and triglycerides) joint to a decrease in totalproteins and albumin levels in the plasma were observed. Glycogen, total proteins andlipids decreased in several organs and tissues, accompanied by a reduction in hepaticand muscular caloric content, indicative of the elevated cost of propanil exposure to theeel in terms of energy reserves. A general increase in lactate levels in all tissues sampledwas observed, indicative of anaerobiosis condition. Propanil also induced disturbancesin the activity of key enzymes as Alanine aminotransferase, Aspartate aminotransferase,Alkaline phosphatase, Lactate dehydrogenase and gamma-Glutamil Transferase. Watercontent increased in several tissues studied as well as Liver Somatic Index (LSI). Mostof the metabolic disorders persisted after a recovery period in pesticide-free waterduring 144 hours. These results revealed that propanil affects the intermediarymetabolism of A. anguilla, and most of the parameters assayed can be used as goodbiomarkers of herbicide contamination.

Los nauplios de Artemia son de uso obligado en acuicultura como alimento para la mayoría de larvas de peces y crustáceos. Su valor nutricional depende esencialmente del perfil de ácidos grasos de sus lípidos. En la actualidad existe gran cantidad de información acerca de la composición de ácidos grasos en quistes y nauplios de diferentes poblaciones de Artemia, sin embargo, se desconocen las causas determinantes de estos perfiles. Este trabajo se centra en el estudio de los factores condicionantes de la composición de ácidos grasos de quistes y biomasas de Artemia profundizando en las relaciones tróficas que se dan en sus hábitats naturales. Gran parte del trabajo se llevó a cabo utilizando como modelo Artemia procedente de Argentina. Las dos especies endémicas de Sudamérica son A. persimilis, hasta ahora hallada sólo en Argentina y Chile, y A. franciscana, existente en el resto del continente americano.El análisis de la composición de ácidos grasos de los quistes de Artemia procedentes de los biotopos argentinos (Capítulo 4) refleja una gran variabilidad mostrando perfiles de ácidos grasos tanto de tipo marino como de tipo dulceacuícola, independientemente del origen costero o continental de sus biotopos y de la composición iónica de las salmueras. Además, se describen por primera vez poblaciones de A. persimilis con elevados porcentajes de ácido eicosapentaenoico (20:5n-3, EPA). La caracterización de las poblaciones mediante marcadores moleculares (RFLPs) (Capítulo 5) confirma los resultados hallados mediante análisis citogenéticos y morfológicos, mostrando una gran divergencia entre las dos especies argentinas de Artemia. La composición bioquímica de Artemia parece estar muy poco marcada por herencia genética, y posiblemente sea complejo averiguar esta influencia. Una primera aproximación molecular, de carácter meramente aleatorio, no permitió la localización de haplotipos adscribibles al fenotipo marino/dulceacuícola de las poblaciones de A. persimilis, aunque no por ello se descarta el efecto genotípico como uno de los factores determinantes de la composición en ácidos grasos de Artemia.Los experimentos realizados en laboratorio revelan que los quistes obtenidos de las poblaciones de Artemia alimentadas con diferentes dietas microalgales, muestran patrones similares a los del alimento suministrado, aunque no de un modo estricto (Capítulo 6). Así, ciertos ácidos grasos, en su mayoría saturados, se presentan en los quistes en niveles independientes al de los hallados en el alimento. Además, se observan diferencias en el perfil de ácidos grasos entre poblaciones, hecho que sugiere un claro componente genotípico. Por otro lado, una dieta mixta con presencia de ácido linolénico (18:3n-3, LNA) y EPA aumenta el fitness de Artemia. A pesar de compartir un mismo haplotipo, las poblaciones mostraron diferencias notables en la fecundidad, lo que podría sugerir la existencia de diferencias genéticas intraespecíficas, no detectadas mediante los marcadores moleculares mitocondriales estudiados.La temperatura (Capítulo 7) tiene un efecto notable sobre el perfil de ácidos grasos de Artemia. Así, a temperaturas más bajas se produce un aumento en el porcentaje de los ácidos grasos insaturados. Este hecho queda demostrado tanto en quistes como en biomasas, donde además, el perfil de ácidos grasos es diferente entre especies (A. persimilis y A. franciscana) siendo esta diferencia más acusada en los primeros. Esta circunstancia vuelve a sugerir un posible efecto genotípico determinante del perfil de ácidos grasos en Artemia.Los estudios realizados en mesocosmos (Capítulo 8) mostraron la influencia conjunta de diversos parámetros físico-químicos y biológicos en la composición de ácidos grasos en diferentes estadios de desarrollo de Artemia. La comparación de la abundancia relativa de los ácidos grasos entre ambas especies (A. persimilis/A. franciscana) revela que las diferencias interespecíficas son mayores que la variabilidad intraespecífica. / The nauplii of the branchiopod crustacean Artemia spp. are widely used as live food in aquaculture. Their nutritional value depends essentially on their fatty acid profile, which can be very variable. Many studies have investigated the composition of fatty acids of cysts and nauplii from different Artemia populations. However, little is known about the factors influencing this composition. The present study focuses on the investigation of factors that determine the fatty acid composition of cysts and biomasses of Artemia.The work was carried out using Artemia populations from Argentina as a model. Two Artemia species are found in Argentinean biotopes, A. franciscana, and the endemic A. persimilis. Original cysts from all Artemia populations exhibited fatty acid profiles typical of either marine - or freshwater - type, irrespective of the inland or coastal origin of their biotope. For the first time, a significant amount of eicosapentaenoic acid (20:5n-3) was reported in A. persimilis cyst samples.Restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis of a fragment of the 16S rRNA mitochondrial gene was used to investigate the genetic diversity and population structure of the Artemia populations from Argentina. The results showed a pattern similar to those of previous cytogenetic and morphological analyses, with the two Argentinean species appearing as highly divergent. A lack of correlation between RFLP patterns and the fatty acid profiles was found.Te effect of diet on the fatty acid composition of Artemia cysts was evaluated. The results revealed a high phenotypic influence of diet. However, some fatty acids, mainly saturated, did not reflect this influence, suggesting specific metabolic pathways.With lowering temperature the amount of highly unsaturated fatty acids in cysts and biomasses of Artemia gradually increases. Significant differences were found between species and among populations in response to temperature changes. Mesocosm studies revealed the influence of diverse physicochemical and biological parameters in the fatty acid profile of different developmental stages of Artemia. Higher percentages of unsaturation in the fatty acids were found in A. persimilis as compared to A. franciscana, demonstrating that a species-specific genotypic effect in the lipid composition should not be discarded.

El treball que he desenvolupat s'ha centrat en l'estudi dels efectes fisiològics de dos metalls pesants, el Cd i el i Ni, en plantes d'arròs durant les etapes inicials del seu desenvolupament. Els objectius concrets d'aquesta tesi són:- Caracteritzar l'efecte del Cd i del Ni sobre les membranes cel·lulars.- Estudiar l'acció del Cd i del Ni sobre el metabolisme energètic. - Determinar les variacions dels nivells d'etilé per efecte dels metalls i la seua possible modulació per altres hormones.Els resultats obtinguts en les nostres investigacions poden resumir-se en:· Tant la permeabilitat de les membranes com la difència de potencial transmembrana (Em) es veuen afectades per Cd, que afecta la component activa d'Em de forma transitòria. Pel contrari el Ni no provoca alteracions d'Em en arrels, ni es detecten augments de la permeabilitat a curt termini, però si en tiges, a llarg termini.· Ambdós metalls afecten dràsticament l'activitat fotosintètica de les plantes i a nivell de planta sencera, no es detecten canvis en l'activitat respiratòria. · El Cd no altera la taxa respiratòria de tiges ni d'arrels, quan es mesuren separadament, excepte a concentracions elevades.· El Ni provoca una clara inhibició de la respiració en les arrels, mentre que augmenta lleugerament la de les tiges. Aquest efecte indica un canvi en la distribució de l'energia que resulta de la respiració entre creixement i manteniment dels teixits. · el Cd i el Ni indueixen una disminució de la síntesi d'etilé. El GA3, però no l'ABA, interacciona amb l'efecte inhibitori dels metalls, i augmenta la producció d'etilé fins a valors semblants als dels controls.· Tots els efectes detectats, i per als dos metalls estudiats, poden ser revertits, al menys parcialment, per l'eliminació dels metalls del medi on creixen les plantes. / Some physiological responses of rice plants to two heavy metals, Cd and Ni, have been studied during the first stages of their development, with the following specific objectives:- Characterization of Cd and Ni effects on plasma membrane functionality.- Study of the effects of these heavy metals on energetic metabolism, which supplies the energy needed for membrane transport.- Evaluation of the changes induced by Cd and Ni in the production of ethylene, the hormone most directly related to variations in membrane stability under stress conditions. The possible interactions of these metals with other hormones have also been studied. The results obtained in these investigations indicate that:- Cd induces rapid and drastic effects on membrane permeability and transmembrane potential difference (Em). However, the effect is transient, possibly due to the existence of inducible detoxifying mechanisms. - Contrastingly, Ni treatments do not affect membrane permeability at the short term, but causes strong losses of K+ at the long term, which may be related with the reduced water content measured in Ni-treated plants.- Both metals affect drastically the photosynthetic performance, which is reflected in a strong decrease in plant growth. - At the whole plant level, respiration is not altered by any of these metals. However, a differential effect of Ni on roots and shoots is observed, indicating a change in the distribution of the energy between growth and maintenance of the tissues.- Both metals induce a decrease in ethylene production, even at metal concentrations which do not alter plant growth. - GA3, but not ABA, interacts with the inhibitory effect of the metals, causing an increase in ethylene production up to values similar to those of controls. - All the effects observed may be reverted, at least partially, by elimination of the metals from the external medium.

El ozono troposférico es el contaminante atmosférico más fitotóxico conocido. El ozono provoca estrés oxidativo en las plantas y sus concentraciones actuales causan importantes disminuciones del rendimiento agrícola en cultivos sensibles. El objetivo general de esta tesis doctoral es el estudio de los efectos de una exposición crónica a ozono durante todo el período de cultivo en plantas de patata (Solanum tuberosum L. cv. Agria). La metodología de cultivo empleada han sido las cámaras de techo abierto (OTC), realizando tres tratamientos: aire filtrado de ozono (CF), aire con concentraciones ambientales de ozono (NF) y aire ambiental enriquecido con ozono (NF+). El primer objetivo ha sido el estudio del efecto del ozono sobre el rendimiento agrícola: se ha encontrado que el tratamiento NF provoca una disminución de un 9-24 %, y el tratamiento NF+ una disminución de un 25-73 %; además existe una alta correlación entre la disminución del rendimiento agrícola y los índices de exposición acumulada a ozono AOT40 y AOT00. En segundo lugar se ha aplicado difenilamina y citrulina a cultivos en campo para evaluar su acción protectora frente al ozono ambiental. Con ambos compuestos químicos, especialmente con la citrulina, se ha encontrado un aumento en el rendimiento agrícola de las patatas comerciales; el mecanismo de acción de ambos agentes parece estar basado en la disminución del estrés oxidativo. El tercer objetivo ha consistido en el estudio de la respuesta del antioxidante glutatión a la exposición crónica a ozono. Como resultado, la concentración de GSSG y, en mayor proporción, la de GSH, han aumentado, de manera que las plantas aumentan la capacidad amortiguadora del glutatión frente al estrés oxidativo; una de las causas del aumento de la concentración de GSH es una mayor síntesis regulada por la expresión de la enzima γ-GCS. El cuarto objetivo ha sido la cuantificación de radicales libres formados por la exposición a ozono mediante espectroscopía ESR en banda X y banda Q. Se ha detectado una señal perteneciente a uno o varios radicales libres permanentes. Además, se ha desarrollado un método de análisis de imagen para cuantificar el área de hoja con síntomas visibles inducidos por ozono. Las técnicas empleadas han permitido encontrar una estrecha relación entre la intensidad de la señal del(de los) radical(es) libre(s) y el porcentaje de superficie foliar con síntomas visibles por ozono. Por último, se ha realizado el estudio de las alteraciones histológicas producidas por la exposición crónica a ozono, así como la detección histoquímica de las especies reactivas del oxígeno radical superóxido y peróxido de hidrógeno. El ozono provoca una degeneración de la lámina media y de la pared celular, además de una pérdida de turgencia de la vacuola, dando como resultado una pérdida de contacto entre las células y finalmente el colapso celular; las células más afectadas han sido las del parénquima lagunar próximas a los estomas. Se ha encontrado un taponamiento del floema debido a la acumulación de calosa, y una acumulación de almidón en las células dañadas del parénquima, fenómenos que podrían ser la principal causa de la disminución del rendimiento agrícola. El radical superóxido se ha detectado principalmente en el parénquima lagunar, concretamente en la pared y/o membrana celular y en membranas intracelulares como el tonoplasto, membrana de los cloroplastos y grana. El peróxido de hidrógeno se ha detectado principalmente en la pared celular, y en los peroxisomas, que se revelan como una fuente importante de esta especie reactiva del oxígeno en condiciones de estrés por ozono; se ha encontrado peróxido de hidrógeno de manera abundante en las paredes del floema, y se discute una posible relación con la acumulación de calosa. / Tropospheric ozone is considered the most phytotoxic air pollutant. The general aim of this thesis is to study the effects of a chronic ozone exposure during the entire growing season on potato plants (Solanum tuberosum L. cv. Agria). Plants were grown in open-top chambers (OTC), and treatments consisted of charcoal-filtered air (CF), ambient air (NF) and ambient air enriched with ozone (NF+). The first aim was to study the effects of ozone on crop yield: the result was a 9-24 % decrease, and a 25-73 % decrease in NF and NF+ treatments, respectively. A strong correlation was found between yield decrease and accumulated ozone exposure indexes AOT40 and AOT00. Secondly, diphenylamine and citrulline were applied to crops in field conditions to test their protective role against ambient ozone. Both chemical compounds, specially citrulline, caused a yield increase in commercial tubers; these compounds seemed to alleviate oxidative stress. Furthermore, glutathione response to chronic ozone exposure was studied. There was an increase in GSSG and GSH concentrations. An enhanced γ-GCS enzyme expression was observed, being a cause for the increase in GSH concentration. Another aim was the quantification of free radicals generated by ozone exposure employing X- and Q-band ESR spectroscopy. A signal belonging to one or several permanent free radicals was detected. Also, an image analysis method was developed to quantify leaf area exhibiting visible ozone symptoms. A strong relationship between free radical(s) signal intensity and percentage of visible ozone-induced damage was found. Finally, research into ozone stress effects on foliar histology was conducted. Ozone caused cell wall degeneration and loss of vacuolar turgence, resulting in the loss of contact between cells and cell collapse. Phloem was blocked by callose, and starch accumulated in injured cells of parenchyma. Superoxide radical was mainly detected in the spongy parenchyma, specifically in the cell wall and/or plasmalemma, tonoplast, chloroplast membrane and grana. Hydrogen peroxide was principally observed in the cell wall, and in peroxisomes, which became an important source of this reactive oxygen species under ozone stress; hydrogen peroxide was abundant in phloem walls, and a possible relationship with callose accumulation is discussed.