La presente investigación se sitúa en el cruce de dos extensos campos de investigación: el asociado con el aprendizaje de las ciencias experimentales y el de la compresión de textos expositivos. En particular centra su atención en el tema "La Evolución de las Especies" con dos propósitos: a) analizar la influencia del conocimiento previo y de ciertas variables textuales que mejoran la coherencia global y facilitan inferencias elaborativas, sobre el aprendizaje del texto medido a través de una tarea típica en ciencias: la resolución de cuestiones; b) estudiar si existen o no, diferencias entre sujetos de alto y de bajo rendimiento en variables asociadas a los procesos de búsqueda de información textual para responder cuestiones. Por ello el trabajo utiliza el saber acumulado en el campo de la didáctica de las ciencias para recopilar información sobre el conocimiento que los estudiantes y público en general tiene sobre el hecho evolutivo y sobre las teorías científicas que lo explican. Asimismo las teorías y modelos de comprensión de textos, así como los trabajos previos sobre tareas de resolución de cuestiones y procesos on-line, son importantes precedentes de esta tesis.Tres experimentos componen la investigación. El primero intenta replicar hallazgos anteriores sobre la importancia del conocimiento previo y de manipulaciones textuales destinadas a facilitar las inferencias elaborativas sin aumentar la coherencia local del texto. El segundo estudia los procesos on-line de búsqueda de información en el texto para contestar preguntas, inferenciales y literales, fáciles y difíciles con el objetivo de detectar patrones diferenciales entre los sujetos con éxito y sin él. El tercero supone una réplica de algunos de los hallazgos del segundo experimento, pero manipulando intencionalmente algunas variables para optimizar el efecto (las diferencias entre sujetos con alto rendimiento y bajo rendimiento). / The present research takes place in the crossing of two extensive fields of investigation: Experimental Science's learning and expositive text's comprehension. Atention is centered in the Species Evolution theme with two purposes: a) analyse the previous knowledge of certain text variables that improve the global coherence and facilitate elaborative inferences upon text learning measured through a typical task in science, the question's; and b) study the presence or not of subjects of high and low learning levels in variables related to searching processes of textual information to answer questions: literal and inferencial, with the purpose of detecting patterns between successful and unsuccessful students. Three experiments compose the investigation. The first one tries to reproduce previous findings over the importance of previous knowledge and textual manipulation to promove elaborate inferences increasing the global text's coherence. To complement results obtained in experiment one, we conducted a second experiment in which we studies information's search processes on-line on text, to answer questions. Finally, the third one shows a study with high school students in order to contrast if in tasks of searching for information to answer high level questions, the students who present low levels of control of comprehension and/or low levels of reading comprehension will have difficulties to differentiate the pertinent information from the non-pertinent. The preceding suggest that the control of the comprehension and the level of reading comprehension can be factors that discriminate against the subjects with high or low learning levels.

Los accidentes cerebrovasculares agudos ("ictus" cerebrales) son trastornos neurológicos originados por la disminución brusca del aporte sanguíneo cerebral ("isquemia cerebral"). La incidencia del ictus en España es de unos 200 casos por cada 100.000 habitantes, lo que le sitúa como la segunda causa de muerte, la primera de invalidez permanente y segunda de demencia.A excepción de la aplicación de la terapia trombolítica, actualmente no existe otro tratamiento eficaz del ictus en clínica. El objetivo genérico del presente trabajo es evaluar el potencial neuroprotector de determinadas sustancias capaces de interferir sobre tres mecanismos fisiopatológicos implicados en el daño cerebral producido por la isquemia-reperfusión: NO, estrés oxidativo e inflamación. Dada la importancia que tiene el modelo experimental en los estudios sobre neuroprotección, previamente se caracterizó el modelo de isquemia cerebral focal transitoria en rata, inducida por oclusión de la arteria cerebral media mediante la "técnica de la sutura intraluminal". Durante los experimentos se monitorizó la perfusión cerebro-cortical (PCC) por láser-Doppler en un área de penumbra isquémica, la presión arterial sistémica (PAS), la pO2 y pCO2, así como el pH y la glucemia en sangre arterial. Finalmente se determinó la afectación neurológica y el tamaño de infarto cerebral resultante.OBJETIVOS:1- El primer objetivo concreto fue evaluar la hipótesis de que el NO producido por el enzima iNOS tras la isquemia origina el descenso tardío en los niveles de ATP, lo cual, a su vez, provoca la liberación tardía de glutamato. Esta secuencia podría contribuir a la progresión del infarto, y por lo tanto su inhibición con el inhibidor selectivo de iNOS 1400W puede resultar beneficiosa en el tratamiento de la isquemia cerebral.2- El segundo objetivo concreto fue evaluar la hipótesis de que la isquemia cerebral elimina la actividad GSH-Px y reduce, consiguientemente, la capacidad antioxidante endógena. Por lo tanto, la recuperación de esta actividad mediante la administración del antioxidante seleno-orgánico mimético de la GSH-Px, ebselén, podría tener efectos beneficiosos sobre el daño cerebral isquémico.3- El tercer y último objetivo fue evaluar la hipótesis de que las fosfolipasas A2 de secreción (sPLA2s) están implicadas en la fisiopatología del daño cerebral isquémico por su participación en el desarrollo de la respuesta inflamatoria, y por lo tanto su inhibición podría tener efectos neuroprotectores. Para ello se utilizó el inhibidor selectivo de las sPLA2s, 12-epi-scalaradial.CONCLUSIONES1- La oclusión transitoria de la arteria cerebral media (90 min de isquemia / 3 días de reperfusión) induce la expresión de iNOS en el cerebro y la sobreproducción tardía de NO, fenómeno que a su vez media la depleción de ATP y la liberación de glutamato. El efecto neuroprotector de 1400W confirma que la producción de NO a partir de la iNOS contribuye al daño producido por la isquemia cerebral y también la posible utilidad de la determinación de L-arginina y L-glutamato en plasma como marcadores del daño isquémico.2- La administración de ebselén en dosis única no reduce el tamaño de infarto tras isquemia severa (2 h de isquemia / 7 días de reperfusión), pese a una ligera preservación de la perfusión intraisquémica, resultados que contrastan con los obtenidos en estudios previos llevados a cabo con isquemias menos severas y tiempos de supervivencia más cortos.3- La administración intracerebroventricular de 12-epi-scalaradial incrementó el tamaño de infarto resultante tras la isquemia (90 min de isquemia /3 días de reperfusión), así como la actividad MPO (marcador de infiltración leucocitaria) en el tejido afectado. Estos resultados sugieren que al menos algunas isoformas de sPLA2s podrían tener un efecto neuroprotector en la isquemia cerebral, y por lo tanto su inhibición resultaría deletérea para el tejido cerebral isquémico. / Ictus are neurological disorders originated by acute cerebral isquemia. Ictus incidence in Spain is of approximately 200 cases for every 100.000 inhabitants, which it places as the second reason of mortality.With the exception of the application of trombolitic therapy, at the moment it does not exist in clinic any other effective treatment for the ictus. The generic aim of the present work is to evaluate the neuroprotective potential of certain substances capable of interfering on three fisiopathological mechanisms implied in the cerebral damage produced by the isquemia-reperfusión: nitric oxide, oxidative stress and inflammation. Previously, the cerebral ischemia induced by transient occlusion of the medial cerebral artery using the intraluminal nylon thread model was characterized.The results confirm the isquemia-reperfusion induced expression of the inducible nitric oxide sintase (iNOS) in the brain, which mediates the ATP fall and the liberation of glutamate. The neuroprotective effect of the iNOS inhibitor, 1400W, confirms that nitric oxide produced by iNOS contributes to the damage produced by the cerebral isquemia and also the possible utility of L-arginina and L-glutamate determination in plasma as scoreboards of the ischemic damage.The administration of a single dose of ebselen, a seleno-organic compound mimetic of the antioxidant glutathione peroxidase enzyme, whose enzymatic activity is inhibited during the isquemia and reperfusion, does not reduce the size of the infracted tissue after severe ischemia in spite of a light preservation of the intraischemic cerebrocortical perfusion. These results do not agree with those obtained in previous studies using less severe ischemic insults and more short survival times.The intracerebroventricular administration of 12-epi-scalaradial, an inhibitor of the secretory phospholipase A2 (sPLA2) activity -supposed involved in the development of the inflammatory response after ischemia and reperfusion-, increased the size of the resultant lesion as well as the leukocytic infiltration in the affected tissue. These results suggest that at least some isoforms of sPLA2 might have a neuroprotective effect in the cerebral ischemia and therefore, its inhibition would be deleterious for the cerebral ischemic tissue.

El término retraso mental se emplea para definir las dificultades en la adquisición de procesos cognitivos y adaptativos que presenta un determinado porcentaje de la población. Este porcentaje oscila en torno al 0,3%-0,5% para los casos graves a moderados y asciende al 2%-3% si se consideran también los casos leves. El retraso mental constituye, por tanto, un problema social y sanitario que se agrava en ambos sentidos cuando se trata de una condición hereditaria. Diversos estudios señalan desde hace años que, en concreto, el retraso mental ligado al cromosoma X es una de las principales causas de déficit psíquico leve y moderado, con una incidencia acumulada estimada en 1:300 a 1:600 varones. Dentro del retraso mental se distinguen, además, formas sindrómicas, cuando éste aparece asociado a otros síntomas de tipo somático, comportamental, neurológico o metabólico, o inespecíficas, si es el único síntoma que presenta el paciente. En este trabajo se ha abordado el análisis de varias familias afectadas de retraso mental inespecífico ligado al cromosoma X, así como de una familia afectada por el síndrome de Prieto, otra afectada por el síndrome de Lenz, y un paciente esporádico con síndrome de Coffin-Lowry. El análisis se ha centrado principalmente en dos regiones: Xp22 en los casos inespecíficos, y Xq11.4 en los sindrómicos, aunque también se han analizado dos genes en Xq24-q25. En la región cromosómica Xp22 se ha estudiado una región de 2,82 Mb, candidata a albergar el gen mutado en 6 familias. Esta región contiene 19 genes, de los que 13 fueron analizados en dichas familias por ser los mejores candidatos. En uno de ellos, FLJ14503, se ha detectado el cambio c.1734G>T, que no ha podido ser identificado en secuencias de las bases de datos ni en muestras procedentes de controles no afectados de retraso mental. Su análisis ha permitido clasificar la proteína que codifica como una nueva proteína asociada a microtúbulos, pero su implicación en el retraso mental aún no ha sido probada, dado que el análisis en células CHO-K1 de la localización subcelular de la proteína, así como del efecto de su sobreexpresión, no ha permitido todavía catalogar dicho cambio como patológico. En la región Xp11.4 se analizaron mediante secuenciación otros 13 genes, sin que ninguno de ellos haya podido ser relacionado hasta el momento con el síndrome de Prieto. Tampoco el análisis cuantitativo de 6 de ellos mostró diferencias significativas entre la expresión de pacientes y controles. El análisis del caso esporádico de síndrome de Coffin-Lowry ha permitido identificar una inserción de un elemento LINE L1 defectivo en el gen RPS6KA3 como la causa molecular de la patología presentada por el paciente. La inserción se ha producido cerca del sitio dador del intrón 3, provocando el skipping del exón 4, lo que conlleva un desplazamiento de la pauta de lectura y la aparición de un codón de parada prematuro.En el caso de la familia afectada por el síndrome de Lenz, se ha identificado la mutación responsable en el gen PQBP1, situado en Xp11.23. De esta forma se amplían tanto la heterogeneidad alélica de este gen, responsable de otros síndromes y de retraso mental inespecífico, como la heterogeneidad génica del síndrome de Lenz, por tratarse del tercer locus asociado a esta enfermedad. / Due to its relative high prevalence, mental retardation constitutes a social and a health problem, and it worsens in the case of hereditary conditions. Several studies have shown that X-linked mental retardation can especially be regarded as one of the major causes of mild to moderate intellectual handicap, showing a cumulative incidence of 1:300 to 1:600 males. In this work we have analysed nine different families: seven of them were affected by non-specific X-linked mental retardation, one suffered from Prieto syndrome and another from Lenz syndrome. In addition, a sporadic patient of Coffin-Lowry syndrome was analysed for mutations in the RPS6KA3 gene. In the case of the non-specific forms, we focused mainly in the Xp22 region, where 13 genes were screened for mutations. The patients of one family displayed a nucleotide change in one of these genes (FLJ14503), that could not be found neither in database sequences nor in control samples. Analysis of the protein encoded by this gene revealed that it might be a novel microtubule associated protein, but its implication in mental retardation remains yet to be proven. Two other genes were screened in Xq24-q25, but no mutations were found. In order to identify the gene responsible for the Prieto syndrome, 13 genes in the Xp11.4 region were screened by sequencing, but none of them could be implicated in the disease. A two base pair deletion in the PQBP1 gene was found to be the cause of the disease phenotype in the Lenz syndrome affected patients. This finding does not only broaden the allelic heterogeneity already described for PQBP1 mutations, it also increases the genetic heterogeneity of the Lenz syndrome itself, as PQBP1 would be the third locus associated with the disease. Analysis of the RPS6KA3 gene showed a de novo insertion of a defective LINE L1 element as the responsible mutation in the Coffin-Lowry patient. The element has inserted close to the splice donor site of intron 3, leading to the skipping of exon 4 in the processed mRNA and the disruption of the reading frame.

La distrofia miotónica tipo 1 (DM1) es una enfermedad neuromuscular que se debe auna expansión de repeticiones CTG inestables en la región 3' no traducida del genproteína kinasa de la DM (DMPK). La DM1 se caracteriza por la miotonía y distrofiamuscular que muestran los pacientes, los cuales también presentan cataratas,arritmias cardiacas y alteraciones neuropatológicas. A nivel bioquímico muestrandefectos en el procesado alternativo de pre-mRNAs específicos lo cual explica algunossíntomas definitorios de la DM1. El mecanismo de patogénesis se debe a la toxicidadde los RNAs con expansiones CUG para la célula. Varias proteínas de unión a RNA,como las proteínas humanas Muscleblind-like MBNL1-3 son secuestradas por lostranscritos mutantes DMPK. Las proteínas MBNL colocalizan con los foci ribonuclearesCUG dentro de los núcleos de músculo y neuronas de pacientes DM1. Existendefectos asociados a DM1 en ratones knockout para Mbnl1 y en moscas mutantesmuscleblind. Nos propusimos generar un modelo en Drosophila de la DM1 paraentender su mecanismo molecular y celular. En primer lugar comprobamos que lasproteínas Muscleblind de Drosophila y la humana MBNL1 eran homólogos funcionales.Un modelo basado en secuestrar la proteína Muscleblind endógena con RNAsportadores de repeticiones CUG sólo sería relevante desde el punto de vistabiomédico si la proteína de Drosophila y la humana realizan funciones equivalentes.Una vez demostrada la conservación funcional entre ambas proteínas mediante elrescate del fenotipo mutante muscleblind expresando la proteína humana, generamosmoscas transgénicas capaces de expresar 60 y 480 repeticiones CUG en un transcritono codificante bajo el control del sistema GAL4/UAS. Detectamos que los RNAs de480 repeticiones CUG formaban inclusiones nucleares y que Muscleblind erasecuestrada por estos transcritos tal y como ocurre en pacientes DM1. La expresiónde RNAs (CUG)480 en músculo mostró una reducción dependiente de la edad en eltamaño de la fibra de los músculos indirectos del vuelo y un aumento en el número devacuolas. Analizamos el patrón de procesado de la α-actinina, un gen muscular, enmoscas que expresan RNAs (CUG)480 y se observó una alteración en los niveles deisoformas. En pacientes también se ha descrito una degeneración en las células de laretina y una pérdida en las neuronas fotorreceptoras. Analizamos la retina de lasmoscas modelo que expresaban RNAs (CUG)480 en el disco de ojo-antena y mostraronalteraciones en la adhesión de las células subretinales y la falta de los rabdómeros delos fotorreceptores. Externamente mostraban un fenotipo de ojo rugoso y ligeramentemás pequeño que utilizamos para comprobar mediante una combinación alélica depérdida de función de muscleblind que las repeticiones CUG estaban interfiriendogenéticamente con la función de este gen. Realizamos una búsqueda demodificadores dominantes con este fenotipo ojo rugoso para identificar genespotencialmente relacionados con el mecanismo de patogénesis de la enfermedad.Identificamos los genes viking y thread entre otros como modificadores y losagrupamos en cinco categorías en función del proceso celular en el que estuvieranactuando; factores de transcripción reguladores, reguladores de la estructura de lacromatina, adhesión celular, apoptosis y metabolismo del RNA. Finalmentecomprobamos in vivo si los RNAs CUG podían ser una fuente de siRNA o miRNAs. Laexpresión de estos RNAs de doble cadena incrementaron los niveles de transcritos demuscleblind por un mecanismo desconocido. En resumen, hemos demostrado queestas moscas reproducen aspectos de la enfermedad humana DM1 y puedenutilizarse para el estudio de la misma. / Myotonic dystrophy type 1 (DM1) is a neuromuscular disease involving the expansionof unstable CTG repeats in the 3´ untranslated region of the DM protein kinase (DMPK)gene. DM1 is multisystemic and characteristic features include myotonia, musculardystrophy, cardiac arrhythmias, and neuropathology. A biochemical hallmark of DM1 ismisregulated alternative splicing of specific skeletal muscle, heart and brain premRNAs.In mice, expression of 250 CUG repeats within a heterologous RNA gives riseto DM1-like phenotypes demonstrating that expanded CUG repeat transcripts are toxicto cells. RNA binding proteins, most notably human Muscleblind-like proteins MBNL1-3are sequestered by mutant DMPK transcripts. MBNL proteins co-localize with CUGribonuclear foci within muscle and neuron nuclei in DM1 patients. DM1-associateddefects are remarkably similar to those observed in Mbnl1 knockout mice andmuscleblind mutations in Drosophila provide additional examples of DM1-likealterations. To understand this toxic RNA gain-of-function mechanism we developed aDrosophila model expressing 60 and 480 CUG repeats in the context of a nontranslatableRNA. Previously, we showed that MBNL1 rescues a muscleblind loss-offunctionphenotype, thus demonstrating functional conservation. CUG-expressing fliesreproduced aspects of the DM1 pathology, including nuclear accumulation of CUGtranscripts, dystrophic muscles that degenerate with age, splicing misregulation, andreduced Muscleblind activity (evident from the enhancement of CUG-inducedphenotypes by a decrease in muscleblind dose). Targeted expression of CUG repeatsto the developing eye was toxic originating eyes externally rough and smaller thannormal. This phenotype was utilized to identify 15 genetic modifiers. These includedviking and thread, which suggest cellular processes previously unknown to be alteredby CUG repeat RNA such as cell adhesion, programmed cell death, nuclear-cytoplasmexport complex ECJ, and chromatin remodelling. We also explored the possibility thatCUG repeat RNA could be a source of small interfering RNAs, thus silencingtranscripts containing complementary sequences such as muscleblind transcriptthemselves. Surprisingly, we detected an increase of muscleblind mRNA in CUGexpressingflies. To sum up, here we describe Drosophila flies that reproduce aspectsof the human disease DM1 and that can find application in the study of DM1.

El gen muscleblind (mbl) es necesario para el adecuado desarrollo del sistema nervioso periférico embrionario y la diferenciación terminal de los fotorreceptores y los músculos en Drosophila. A partir del único gen muscleblind de Drosophila se generan cuatro transcritos por procesado alternativo que codifican para cuatro proteínas caracterizadas por la presencia de dedos de zinc del tipo Cys3H. Los homólogos de muscleblind en vertebrados son los genes Muscleblind-like1, 2 y 3 (MBNL1-3). Las proteínas humanas MBNL1, 2 y 3 tienen la capacidad de modificar el procesado alternativo de diversos transcritos y tienen un papel importante en la patogénesis de la distrofia miotónica (DM). La DM es una enfermedad autonómica dominante generada por la expansión del trinucleótido CTG en una región no codificante del gen DMPK. La presente tesis recoge experimentos realizados en diferentes sistemas para desvelar la función molecular de las proteínas Muscleblind de Drosophila. Este trabajo demuestra la conservación de la actividad como factores de splicing alternativo y la ruta patogénica de la DM en moscas. Se describen dos nuevas dianas moleculares de las proteínas Muscleblind, los transcritos de la alpha-actinina y la troponinaT, cuyo patrón de splicing está alterado en mutantes mbl y en moscas que expresan repeticiones CUG. Además, mediante experimentos en cultivo celular se muestra la capacidad de estas proteínas de inducir muerte celular al ser sobre-expresadas en células S2 de Drosophila. Las isoformas de Muscleblind mostraron diferente capacidad en los distintos ensayos funcionales realizados. Mediante experimentos de sobre-expresión en células de vertebrado y mutagénesis dirigida mostramos la implicación de los extremos carboxilo en la diversificación funcional de las isoformas de Muscleblind. Las isoformas se localizan en distintos compartimentos sub-celulares y la eliminación de un sitio putativo de sumolización (FKRP) conservado altera la capacidad de inducir muerte celular de MuscleblindC. / The human Muscleblind-like proteins MBNL1-3 bind RNAs through pairs of zinc fingers of the Cys3His type. They have the ability to modify alternative splicing and sub-cellular localisation of defined transcripts and their function is impaired in myotonic dystrophies type 1 and 2 (DM1 and DM2). DMs are autosomal dominant neuromuscular diseases characterized by myotonia, muscle weakness, and iridescent cataracts, among other symptoms. At a molecular level, DM patients show disruption of alternative splicing regulation of specific transcripts. The genetic cause of these diseases is the expansion of either a CTG or a CCTG repeat in non-coding regions of the DMPK (DM1) and ZNF9 (DM2) genes. Upon transcription, expanded RNAs form stable hairpins, which sequester nuclear factors depleting them from their normal function. Among those factors are the MBNL proteins. The relevance of MBNL sequestration in DM pathogenesis is supported by muscleblind like 1 knock-out mice (Mbnl1DE3/DE3), which reproduce the main features of DM patients including myotonia, cataracts, and RNA splicing defects in transcripts such as troponinT 2 and 3. Furthermore, expression of Mbnl1 protein reverts the DM-like alterations of mice expressing expanded CUG containing RNA.

Los viroides, los agentes infecciosos más pequeños descritos hasta la fecha (246-401 nt), están constituidos únicamente por una molécula circular de RNA de simple cadena. A pesar de su tamaño y de no codificar proteínas son capaces de replicarse autónomamente, moverse sistémicamente, y causar enfermedades en plantas susceptibles gracias a su capacidad para interaccionar con factores del huésped. Dichas propiedades biológicas y moleculares hacen de estos patógenos un excelente modelo para abordar el estudio de cuestiones básicas sobre la relación entre la estructura del RNA y su función.La replicación de los viroides transcurre según un mecanismo de círculo rodante en el que sólo intervienen intermediarios de RNA. Este proceso conlleva tres etapas: i) la transcripción reiterada del RNA circular monomérico infeccioso más abundante, al cual se la asigna arbitrariamente la polaridad positiva, ii) el corte de los RNAs oligoméricos de una o de ambas polaridades, y iii) la ligación de los RNAs monoméricos lineales resultantes. Mientras que para los viroides cloroplásticos (familia Avsunviroidae) se conoce el sitio de corte de los RNAs oligoméricos y la actividad catalítica implicada (ribozimas de cabeza de martillo que sus RNAs de ambas polaridades pueden adoptar), para los viroides nucleares (familia Pospiviroidae) ambos aspectos son controvertidos.En el presente trabajo hemos abordado el estudio del procesamiento (corte de los RNAs oligoméricos de polaridad positiva y ligación de los RNAs monoméricos lineales) de los viroides nucleares utilizando una metodología in vivo basada en plantas de Arabidopsis thaliana que expresan transcritos diméricos de tres miembros de la familia Pospiviroidae. Mediante el análisis del extremo 5' de los RNAs monoméricos lineales procesados in vivo (en plantas transgénicas o en plantas huésped infectadas), hemos identificado el sitio de corte en un motivo conservado en la familia: la rama superior de la región central conservada (CCR, central conserved region). Las secuencias que la componen y las repeticiones invertidas que la flanquean pueden adoptar un plegamiento en horquilla o, alternativamente, una estructura de RNA bicatenario palindrómico en RNAs oligoméricos. El sitio de corte determinado se localiza en posiciones estructuralmente equivalentes en los tres viroides estudiados, lo que sugiere la implicación de una o de ambas estructuras en la etapa de corte. Los datos obtenidos con varias líneas transgénicas de A. thaliana que expresan cDNAs diméricos de uno de los tres viroides mutados en posiciones definidas de la CCR han permitido concluir que el sustrato de la reacción de corte debe ser la estructura de RNA bicatenario palindrómico y que el bucle E, presente en la conformación en varilla de algunos miembros de la familia, participa en la reacción de ligación aunque no es el único motivo estructural relevante. Es de destacar que el modelo propuesto en este trabajo es aplicable a todos los miembros de la familia Pospiviroidae, y difiere de los modelos previos basados en estudios in vitro que tienen una aplicación más restringida.Los sitios de corte en la conformación que contiene el RNA bicatenario palindrómico generan RNAs monoméricos lineales con extremos 3' con dos nucleótidos protuberantes, la huella característica de las RNasas III. La caracterización de los grupos químicos terminales de los RNAs monoméricos lineales procesados in vivo indica la presencia de extremos 5'-P, 3'-OH compatibles con la actividad de una enzima de esta familia y con una RNA ligasa distinta a la única caracterizada en plantas. / Viroids are small, circular, noncoding RNAs that currently are known to infect only plants. They also are the smallest self-replicating genetic units known. Without encoding proteinsand requirement for helper viruses, these small RNAs contain all the information necessary to mediate intracellular trafficking and localization, replication, systemic trafficking, and pathogenicity. All or most of these functions likely result from direct interactions between distinct viroid RNA structural motifs and cellular factors. Viroids present a simple model system to address some basic questions about the RNA structure-function relationships.Replication of viroids entails reiterative transcription of their incoming single-stranded circular genomes, to which the (+) polarity is arbitrarily assigned, cleavage of the oligomeric strands of one or both polarities to unit-length, and ligation to circular RNAs. While cleavage in chloroplastic viroids (family Avsunviroidae) is mediated by hammerhead ribozymes, where and how cleavage of oligomeric (+) RNAs of nuclear viroids (family Pospiviroidae) occurs in vivo remains controversial.In the present work we have re-examined this question in vivo, using transgenic Arabidopsis lines expressing three dimeric nuclear viroid RNAs and host plants infected. Using this methodology, we have mapped the processing site of these three members at equivalent positions of a conserved region (the hairpin I/double-stranded structure that the upper strand and flanking nucleotides of the central conserved region can form). Together with mapping the in vivo processing site, our results with sixteen mutants of one of these viroids support that cleavage is directed by an RNA motif conserved in all members of the family, and ligation by an extended conformation containing a motif termed loop E. These results have deep implications on the underlying mechanism of both processing reactions, which are most likely catalyzed by enzymes different from those generally assumed: cleavage by a member of the RNase III family, and ligation by an RNA ligase distinct from the only one characterized so far in plants, thus predicting the existence of a least a second plant RNA ligase.

En el periodo 1991-2002 la prevalencia de infección por virus de la hepatitis C (VHC) en la población de donantes de sangre de la Comunitat Valenciana ha disminuido un 66%, estando en el último año (2002) alrededor del 0.27%. En general, la prevalencia en nuestra Comunidad fue superior a la media de España y a la de otros países europeos y similar a la de Estados Unidos y Japón. En cuanto a la tasa de incidencia de la infección por VHC en donantes de sangre, la Comunitat Valenciana ha disminuido en el periodo de estudio casi 30 veces, llegando a un valor de 3.4 x 105 donante-años en 2002, presentando una tasa superior a la del resto de España y de los demás países considerados. Por tanto, el riesgo residual ha disminuido también en este periodo, llegando a ser de 1.12 x 106 donaciones en 2002. Este valor también ha sido superior respecto a los demás países comparados. Entre las distintas provincias de la Comunitat Valenciana hay diferencias significativas entre los valores de prevalencia anual, siendo en el periodo 1991-1999 mayores en las provincias de Valencia y Castellón que en la provincia de Alicante (p<0.05). En cambio, en el periodo 2000-2002 los valores de prevalencia de VHC en Alicante han sido similares a los de las provincias de Valencia y Castellón.A lo largo del periodo 1990-2002, han ido disminuyendo los valores de prevalencia, incidencia y riesgo residual de transmisión de VHC. La disminución del riesgo residual se ha producido en parte por el aumento de sensibilidad en las pruebas de cribado. La exclusión de los donantes con riesgo de transmitir el VHC y la información recibida por la población general sobre las vías de contagio de la infección han contribuido, probablemente, al descenso de la prevalencia e incidencia. En cuanto a las técnicas clásicas de detección de anticuerpos empleadas en el estudio, la especificidad de las pruebas serológicas de cribado de 3ª generación para la detección de anticuerpos anti-VHC (99.84%) ha sido mayor que la de las pruebas de 2ª generación (p<0.05). Respecto a las pruebas serológicas de confirmación, la proporción de resultados indeterminados obtenidos con las pruebas de 2ª y 3ª generación ha sido similar (25-30%).La introducción de la pruebas amplificación genómica (NAT) en 1999 para el cribado de todas las donaciones de sangre en la Comunitat Valenciana no ha supuesto grandes dificultades y ha reducido el periodo ventana de la infección por VHC y, por tanto, el riesgo residual. El rendimiento observado con la introducción de las pruebas de detección genómica del VHC en la Comunitat Valenciana, entre 1999 y 2006 ha sido de una donación en periodo de ventana serológico por cada 320000 unidades de sangre. Este rendimiento es superior al obtenido en otros centros de transfusión españoles, europeos y de Estados Unidos, lo cual podría deberse a la prevalencia de infección por VHC más elevada en nuestra comunidad. El rendimiento esperado por la introducción de dichas pruebas NAT en el periodo 2000-2002 ha resultado ser similar al rendimiento NAT observado. La puesta en marcha de la prueba NAT en el cribado de donaciones de sangre, ha hecho que sea innecesaria la prueba de cuantificación de la enzima alanina aminotransferasa (ALT) para la detección de infección por VHC en las fases iniciales de la enfermedad. / In the period 1991-2002 the prevalence for HCV infection in the population of blood donors of the Valencian Region has dropped 66%, being in the last year (2002) around 0.27%. As the incidence rate of the infection for HCV in the Valencian blood donors has been reduced in the period of study 30 times, reaching 3.4x105 donor-years in 2002, the residual risk has also dropped in this period, being of 1.12x106 donations in 2002. Among the different provinces of the Valencian Region there are significant differences on annual prevalence, being the provinces of Valencia and Castellón higher than the province of Alicante (p<0.05) in the period 1991-1999. On the other hand, in the period 2000-2002 the prevalence of HCV in the three provinces have been similar. Along the period 1990-2002, the prevalence, incidence and residual risk of transmission of HCV have continued dropping. The decrease of the residual risk has taken place partly due to the increase of sensibility in the screening tests. The exclusion of the donors with risk of transmitting the HCV infection and the public awareness of infection has probably contributed to the descent of the prevalence and incidence rates. As regards the antibodies detection test used in the study, the specificity of screening serologic test of third generation (99.84%) for detection of the Hepatitis C Virus (HCV) has been higher than that of second generation test (p<0.05). About the confirmation serologic test, the proportion of indeterminate results obtained with the second and third generation test has been similar (25-30%). The introduction screening genomic test (NAT) in our center has not been difficult, the window period of the infection for HCV has been reduced and thus, the residual risk. Between 1999 and 2006, the observed yield with the introduction of the genomic test for detection of the HCV in the Valencian Region, has been 1:320000. This observed yield has been similar to the expected yield by NAT test between 2000 and 2002. Due to the implementation of the NAT screening test in blood donations, the alanine aminotransferase (ALT) quantification test for the detection of HCV in the initial phases of the illness is unneccessary.

En los vertebrados, las gonadotrofinas (FSH y LH) son hormonas esenciales en el control de la gametogénesis y esteroidogénesis gonadal. Sus acciones están mediadas por la activación de sus respectivos receptores. A pesar de su importancia en la función reproductora, en teleósteos se dispone de muy poca información relativa a estos receptores. En este trabajo se investigaron las características moleculares, estructurales y funcionales de los receptores de gonadotrofinas (FSHR y LHR) de un teleósteo marino, la lubina (Dicentrarchus labrax). Además, se evaluó la especificidad de unión al ligando de estos receptores. Usando un método de RT-PCR cuantitativo, se midieron los perfiles de expresión de los receptores de gonadotrofinas durante la primera maduración gonadal de machos y hembras de lubina. Asimismo, se investigaron posibles relaciones entre estos perfiles, los de la proteína responsable de la respuesta aguda de la esteroidogénesis (StAR) y los perfiles plasmáticos de esteroides sexuales. Estudios recientes realizados en diversas especies de peces sugieren que el receptor de TSH (TSHR), que comparte características estructurales con los receptores de gonadotrofinas, podría estar directamente implicado en la fisiología gonadal. Por ese motivo, en este trabajo se investigó una posible participación del TSHR en la función reproductora de la lubina. Los resultados obtenidos contribuyen a entender en que momento del ciclo reproductor las células germinales en crecimiento son sensibles a las señales procedentes de la hipófisis (gonadotrofinas). Además, se ha demostrado que, a diferencia de otros peces, las interacciones entre los receptores de gonadotrofinas de lubina y sus respectivos ligandos son específicas. Asimismo, podemos decir que en la lubina, los receptores de gonadotrofinas se expresan en momentos diferentes del ciclo reproductor. Esto apoya la idea de que la FSH y la LH poseen diferentes acciones en el control de la función gonadal. Desde de un punto de vista aplicado, estos conocimientos podrían ser de gran importancia en la manipulación del ciclo reproductor de esta especie de gran valor económico. Por lo tanto, estos estudios son relevantes tanto por su componente de investigación básica como por las posibles aplicaciones que pueden derivarse. / In vertebrates, the pituitary gonadotropins, follicle-stimulating hormone (FSH) and luteinizing hormone (LH), are the main regulators of gametogenesis and gonadal hormone production. To exert their biological actions, gonadotropins must bind to, and activate specific cell-surface receptors. The primary aim of the studies underlying this thesis was to investigate the role of gonadotropins in the sea bass (Dicentrarchus labrax) reproductive function by studying their cognate receptors. Two cDNAs encoding a FSH receptor (sbsFSHR) and a LH receptor (sbsLHR) were cloned and characterized. Their gene structure, expression, and functional activity were evaluated. Sea bass FSHR and LHR mature proteins display typical features of the glycoprotein hormone receptor family members, but the sbsFSHR also contains some remarkable differences when compared with other fish or mammalian FSHRs. Among them, a distinct extracellular N-terminal cysteine domain as regards to its length and cysteine number, and the presence of an extra leucine-rich repeat. sbsLHR is more conserved than sbsFSHR when comparing their genomic primary structures with other vertebrate gonadotropin receptors, particularly in the extracellular domain. Furthermore, two alternately spliced variants of the sbsFSHR were amplified. Both correspond to transcripts originated by removal of exons from the extracellular domain. Expression analysis revealed that the sbsFSHR is exclusively expressed in gonads, specifically in the wall of previtelogenic and early-vitelogenic follicles. On the contrary, sbsLHR mRNA was found to be widely distributed in somatic tissues. Recombinant sbsFSHR was specifically stimulated by bovine FSH, while sbsLHR was activated by both bovine LH and FSH. Nevertheless, specific stimulation of both sea bass FSHR and LHR was observed when recombinant sea bass gonadotropins were used advancing specific interactions. This behaviour differs from studies in other teleost where promiscuous activation was reported. The expression profiles of sea bass gonadotropin receptors were investigated in the gonads of both sexes during a complete reproductive cycle, in parallel with the expression of steroidogenic acute regulatory protein (StAR) gene and reproductive hormones. While in male sea bass, both gonadotropin receptors show different expression patterns, in females their expression patterns were somehow similar. Expression of the sbsFSHR was connected with early stages of gonadal development, but also with the spermiation period in males and the maturation-ovulation period in female. The expression profile of the sbsLHR, in both sexes, supports the already suggested involvement of LH in the regulation of the final stages of fish gamete maturation and ovulation/spermiation. sbsStAR expression was strongly correlated with sbsLHR expression. In addition, the expression profile obtained for sbsStAR suggests that this protein mediates the rapid delivery of sterol substrate for the synthesis of gonadal maturation inducing steroids. No strong relationship between gonadotropin receptor expression and plasma levels of the analysed sex steroids was seen. Further studies will be needed to understand how gonadotropins and sex steroids interact to regulate sea bass reproduction.Recent studies reported abundant expression of TSHR transcripts in both the ovary and testis of some fish species. To help elucidate the physiological role that TSHR may have in the gonadal function of sea bass, a cDNA encoding a TSHR was isolated from the gonads of this fish species. The mature protein displays typical features of the members of the glycoprotein hormone receptor family. By RT-PCR analysis we demonstrate the extra-thyroidal expression of sbsTSHR in numerous tissues of the sea bass. Seasonal changes in sbsTSHR mRNA levels in female and male sea bass during puberty suggest that in females the TSHR could participate in active vitellogenesis and in the regulation of gamete maturation and ovulation, whereas in males, the TSHR would be involved in the regulation of early stages of the gonadal development and also of gamete maturation and spermiation.

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Una de las estrategias más satisafactorias empleadas en la lucha contra el cáncer es la utilización de la terapia génica para actuar en la inmunomodulación, es decir la actuación sobre el propio sistema inmunitario del paciente para que sea éste quien reconozca al tumor como algo foráneo, que no escape a la inmunovigilancia y lograr destruirlo. En esta tesis doctoral hemos explorado bajo este concepto las vacunas por terapia génica no viral, tanto preventivas como terapéuticas, trabajando bien con antígenos aislados y genes como con células y genes. Los experimentos en modelo de melanoma murino, se han divido en tres grandes bloques. 1) En las vacunas preventivas con antígenos, se obtuvieron diferentes tasas de reducción de volumen tumoral, acompañadas de producción de inmunnoglobulinas G específicas frente al tumor tratado. Se obtuvieron los mejores resultados en modelos de vacunación con acondicionamiento tisular en los que inicialmente se acondicionaba al animal con los antígenos purificados, transfectando posteriormente con plásmidos desnudos productores del gen de mGM-CSF. 2) En las vacunas preventivas celulares, transfectando células B16 con plásmidos portadores de los genes de mGM-CSF, mIL-12, mB7.2 y combinaciones entre ellos, se obtuvo la protección total frente al tumor en los animales vacunados con 3 dosis de 2x105 células transfectdas, irradiadas, no seleccionadas. Además se demostró que la vacunación había generado memoria inmunológica, al repetir la exposición al tumor en los mismos animales un año después y volver a lograr la protección total. Adicionalmente se realizaron experimentos de vacunación exclusivamente con las células transfectadas, seleccionadas y purificadas mediante bolas magnéticas. 3) Por último, se realizaron experimentos de vacunación terapéutica, en animales portadores de tumor, siguiendo el modelo de células transfectadas. Se probaron diferentes dosis celulares y el tratamiento previo con ciclofosfamida. Los mejores resultados de inhibición tumoral y prolongación de la supervivencia se obtuvieron en las vacunas con 2 millones de células/dosis. Finalmente se realizó una primera aproximación al estudio del bloqueo del éxito de la vacunación terapéutica, analizando la población de células T reguladoras en los animales tratados. / One of the most satisfactory strategies against cancer is the use of gene therapy for immunemodulation, that is acting over the patient's immune system in order to make it recognize the tumor and fight properly against it. In this thesis, we have explored the nonviral gene therpy vaccines under this concept, working with preventive as well as therapeutic models, with purified antigens and genes and also with whole cells and genes. The experiments have been performed with a murine melanoma model and been divided in three sets. 1) In preventive antigen vaccines, different rates of tumor growth inhibition were obtained, acompained by specific antitumor immunoglobulin G production. The best results were obtained with tissue conditioning, where the animals were firstly conditioned with purified tumor antigens and later the tissues were transfected in vivo with naked plasmids producing mGM-CSF. 2) In preventive cell vaccines, transfecting B16 cells with plasmids bearing mGM-CSF, mIL-12, mB7.2 genes alone or combined, total tumor protection was obtained vaccinating with 3 doses of 2x105 transfected, irradiated, non selected cells. This vaccine also showed immunological memory since a second challenge to the tumor in the same animals one year later also reached total protection. In addition, experiments vaccinating only with the selected population of transfected cells, by means of magnetic beads, were performed. 3) Finally, therapeutic vaccines were evaluated, continuing with transfected cells. Different cell doses and pretreatment with cyclophosphamide were tested. The best results of tumor growth inhibition and survival were obtained with 2 million transfected cells/dose. A first approach to the study of the blockade in therapeutic model success was performed analysing the regulatory T cell population in the treated animals.