La propagación de una infección viral en plantas está mediada por unasproteínas codificadas por el propio virus denominadas proteínas de movimiento(MP). Estas proteínas unen el genoma viral de forma cooperativa y sinespecificidad de secuencia, formando unos complejos RNA-MP, que se asocian,en la mayoría de casos, al retículo endoplasmático (RE) para ser transportadosmuy posiblemente a través del citoesqueleto hacia los plasmodesmos, canalesmembranosos que interconectan las células en plantas. Una vez estos complejosalcanzan los plasmodesmos, el RNA viral es translocado a las célulasadyacentes a través de un mecanismo todavía desconocido.A pesar de la variabilidad entre las distintas familias virales en elnúmero y tamaño de este tipo de proteínas, se ha descrito que muchas de estasMPs interaccionan con las membranas celulares. Sin embargo, la naturaleza deesta interacción y los mecanismos que subyacen a este fenómeno no se hanexplorado todavía. Así pues, el objetivo central de la presente tesis se ha basadoen el estudio y caracterización de la asociación de estas proteínas con lamembrana del RE. El virus objeto de estudio ha sido el Virus del Moteado delClavel, que codifica dos MPs, p7, una proteína soluble capaz de unir el genomaviral y p9, que presenta dos regiones hidrofóbicas susceptibles de interaccionarcon las membranas celulares.En primer lugar, mediante experimentos de transcripción/traducción invitro se ha demostrado que p9 es una proteína integral de membrana quecontiene dos fragmentos transmembrana y adopta una orientación N-/Cterminalcitoplasmática.En segundo lugar, se ha caracterizado el mecanismo a través del cual p9alcanza las membranas celulares. Los resultados obtenidos demuestran que lainserción de p9 tiene lugar de forma co-traduccional y es dependiente de SRP,un complejo ribonucleoproteico que, en general, participa en eldireccionamiento de proteínas a la membrana del RE. Además, el virus explotala propia maquinaria celular responsable de la integración de las proteínas demembrana celulares. Así, el complejo Sec61 y la proteína TRAM participan en elproceso de inserción de p9. Entre los resultados obtenidos cabe destacar que (i)los segmentos transmembrana de este virus se integran en la membrana através de un mecanismo secuencial y ordenado desde Sec61a a TRAM; y (ii) laproteína TRAM media la integración de esta proteína viral desempeñando unaposible función de reclutamiento de segmentos transmembrana antes de queéstos particionen conjuntamente a la bicapa lipídica, una vez completada latraducción de la proteína.Finalmente, se ha realizado un estudio de los determinantes topológicosde la proteína que determinan su orientación en la membrana. Se ha exploradola contribución de toda una serie de parámetros, que se han establecido comodeterminantes en el caso de proteínas de membrana de procariotas o eucariotas.Entre estos factores se encuentran la presencia de residuos cargados en lasecuencia de la proteína, la hidrofobicidad de los fragmentos transmembrana, lalongitud de dominios extramembranosos y/o la presencia de residuosaromáticos en las regiones flanqueantes de los propios segmentostransmembrana. Los resultados demuestran que la proteína viral p9 presenta lainformación topológica distribuida a lo largo de la secuencia de aminoácidos dela proteína. Esta estrategia impediría que la posible aparición de una mutaciónno conservativa en el gen de la proteína, proceso muy habitual durante lareplicación de los genomas virales, alterara la orientación de la proteína en lamembrana y en definitiva, comprometiese su función biológica. / The cell-to-cell movement of plant virus is assisted by the viral so-called"movement proteins" (MP). Functions assigned to these proteins include nucleicacid binding, targeting to the endoplasmic reticulum (ER), and modification of the sizeexclusion limit of the plasmodesmata, a membranous channel that connectadjacent cells. Although the number and size of these proteins vary from viralfamilies it has been described that many of the viral MPs interact with the membranesbut the nature of this interaction is not well defined yet. Therefore, the main goal ofthis study is the characterization of MPs interaction to the ER membranes. TheCarnation Mottle Virus has been used as an experimental model. This virusencodes two MPs, a cytoplasmic soluble protein of 7 kDa, p7, which binds viralgenome, and a hydrophobic protein of 9 kDa, p9, with two putativetransmembrane segments.Firstly, it has been demonstrated that p9 is, in fact, an integral membraneprotein containing two transmembrane segments and facing both N- and Cterminusto the cytosol.Secondly, it has been dissected the cellular pathway followed by p9 toreach the host membranes. This viral protein is targeted to ER membrane by thesignal recognition particle, and the translocon components Sec61a and TRAMmediate p9 integration into the membrane. The unexpected results obtained inthese studies are the following: (i) viral TM fragments integrate into the lipidbilayer through a sequentially ordered contact to Sec61a and TRAM; and (ii)TRAM mediates viral protein integration by collecting TM domains, which areonly partitioned into the lipid bilayer after translation termination.Finally, it has been studied the topological determinants of p9 thatgovern the proper orientation of this viral membrane protein. It has beenanalysed contribution of different parameters such are distribution of positiveresidues along the protein sequence, hydrophobicity of transmembranesegments, length of extramembranous domains, and presence of aromaticresidues flanking transmembrane domains. The results demonstrate thattopological information of p9 is distributed along the amino acid sequence. Thisstrategy could avoid any alteration of native topology of p9 due to a randommutation in the protein gene, a common process during viral genomereplication.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UV/oai:www.tdx.cat:10803/9537 |
| Date | 27 April 2006 |
| Creators | Saurí Peris, Ana |
| Contributors | Mingarro Muñoz, Ismael, Universitat de València. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat de València |
| Source Sets | Universitat de València |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess, ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs. |
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