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Previous issue date: 2007-12-04 / Yellow fever is an infectious disease caused by the yellow fever virus (YFV), a Flavivirus transmitted to humans by Aedes aegypti mosquitoes. Despite the existence of the yellow fever vaccine, the disease is endemic in South America and Africa, causing public health problems such as dispersed outbreaks, epidemics with variable impact and the risk of re-emergency of the urban cycle due to the occurrence of sylvatic disease. Aim. The knowledge of the components of YFV replication complex is still incipient but it is known that there are interactions among viral RNA, viral proteins and host proteins and, due to evidences of the existence of protein-protein interactions related to the NS5 protein of other Flavivirus, the target of our study was YFV NS5 protein. Once protein-protein interactions present basic importance for the activation, the regulation and the control of diverse biologic functions related to these interactions, the identification and the characterization of them are essential for a better comprehension of the pathogenesis and for the rational design of drugs for YFV. Material and Method. The YFV NS5 gene was divided in its two domains, which were independently cloned in a GAL4 DNA-BD plasmid, generating the methyltransferase (MT) and RNA polymerase (RNApol) baits. A two-hybrid system screening in Saccharomyces cerevisiae AH109 strain was performed utilizing RNApol bait and cDNA library of Hela cells, which was cloned in a GAL4 AD plasmid. MT bait showed to be toxic for the yeast. Results. All 204 obtained transformants were tested for activation of reporter genes HIS3, ADE2 and lacZ from AH109 and only 35 samples indicated positivity to, at least, two of the reporter genes assessed. Thirty three distinct cellular protein partners of the RNApol NS5 were identified after the sequencing of the clones and the comparison of its sequences with GenBank. Proteins Snf5, p54NRB, HMG20B, U1A, eIF3S6IP, GIPC PDZ and MIF were chosen for next experiments. A plasmid linkage with these proteins was performed to exclude the possibility of false-positive clones and to confirm the protein-protein interactions identified in the initial screening. RNApol regions responsible for the Snf5 and eIF3S6IP interactions were mapped and a region of approximately 80 aminoacids was identified as the minimum domain requested for the interactions, called fragment A. Conclusion. The prominence of this YFV fragment as a determinant of protein interactions became more evident when its sequence was compared to the sequences of other Flavivirus, signalizing a homology from aminoacid 20 to 80, demonstrating that this fragment is a conserved region. Moreover, the production of a similarity model of RNA polymerase domain of YFV NS5 protein, using the known DENV NS5 protein structure, showed that the region of interaction is exposed and potentially capable of forming interactions. / A febre amarela é uma doença infecciosa causada pelo vírus da febre amarela (yellow fever virus YFV), um Flavivirus transmitido ao homem pela picada do mosquito Aedes aegypti. Mesmo com a existência de uma vacina anti-amarílica, a enfermidade conserva-se endêmica na América do Sul e na África, gerando problemas de saúde pública que incluem surtos isolados, epidemias de impactos variáveis e, principalmente, o risco da possível re-emergência da sua forma urbana a partir da ocorrência de surtos silvestres. Objetivo. Embora sejam mínimas as informações sobre os componentes do complexo de replicação do YFV, sabe-se que nele estão envolvidas interações entre o RNA viral, proteínas virais e proteínas do hospedeiro e, devido às evidências de interações proteína-proteína relacionadas à proteína NS5 de outros Flavivirus, o alvo principal do nosso trabalho foi NS5 do YFV. Como interações protéicas são de fundamental importância para ativação, regulação e controle de diversas funções biológicas a elas relacionadas fica evidente a relevância da identificação e caracterização das interações participantes desse processo para uma melhor compreensão da patogênese e para o desenho racional de drogas contra a febre amarela. Material e Método. O gene NS5 de YFV foi dividido em seus dois domínios, os quais foram clonados independentemente no plasmídeo com DNA-BD de GAL4, gerando as iscas metiltransferase e RNA polimerase. Em seguida, foi realizado um screening em sistema duplo-híbrido com a isca RNApol contra biblioteca de cDNA de células Hela clonada em vetor com AD de GAL4, uma vez que MT mostrou-se tóxica para a levedura hospedeira do experimento Saccharomyces cerevisiae, linhagem AH109. Resultados. Os 204 transformantes obtidos foram testados quanto à capacidade de ativação dos genes repórteres HIS3, ADE2 e lacZ de AH109 quando, então, apenas 35 amostras mostraram-se positivas para pelo menos dois dos repórteres testados. Após o seqüenciamento nucleotídico desses clones e comparação das seqüências com o GenBank, os resultados indicaram seqüências nucleotídicas codificadoras para 33 proteínas celulares diferentes como parceiras interativas de RNApol NS5, dentre as quais foram eleitas as proteínas Snf5, p54NRB, HMG20B, U1A, eIF3S6IP, GIPC PDZ e MIF para o prosseguimento dos experimentos. Para excluir a possibilidade de pertencerem a uma classe de clones falso-positivos e confirmar as interações proteína-proteína identificadas na triagem inicial, foi efetuado o plasmid linkage. Após tal confirmação, foram mapeadas as regiões em RNApol responsáveis pelas interações com Snf5 e eIF3S6IP, tendo sido descoberta uma mesma região de aproximadamente 80 resíduos aminoácidos como o domínio mínimo requerido para tais interações, a qual foi denominada fragmento A. Conclusões. A relevância do fragmento A de YFV como determinante das interações protéicas tornou-se mais evidente quando sua seqüência foi comparada à de outros Flavivirus, mostrando a presença de uma homologia principalmente entre os aminoácidos 20 a 80, demonstrando que esse fragmento se comporta como uma região conservada entre os Flavivirus considerados. Além disso, a geração de um modelo de similaridade do domínio RNA polimerase da proteína NS5 de YFV, a partir de NS5 de DENV, demonstrou que a região de interação está exposta ao solvente, sendo, portanto, potencialmente capaz de formar interações.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:localhost:tede/50 |
| Date | 04 December 2007 |
| Creators | Madrid, Maria Carolina Ferrari Sarkis |
| Contributors | Nogueira, Maurício Lacerda, Bonjardim, Claudio Antonio, Silva, Eloiza Helena Tajara da |
| Publisher | Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, FAMERP, BR, Medicina Interna; Medicina e Ciências Correlatas |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da FAMERP, instname:Faculdade de Medicina de São José do Rio Preto, instacron:FAMERP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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