El carcinoma de pulmó de cèl·lula no petita (CPCNP) és un dels tumors més freqüents en la població caucàsica en què la histologia més comuna és l’adenocarcinoma. En diversos estudis clínics es va observar que un subgrup de pacients amb CPCNP avançat, amb unes característiques molt concretes (sexe femení, d’histologia adenocarcinoma i no fumador), es beneficiaven del tractament amb uns inhibidors de l’activitat tirosina quinasa (ITQ) d’EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor). Les mutacions en aquest domini del gen EGFR, descobertes l’any 2004, van ser descrites com les responsables de les respostes als ITQ. El 90% d’aquestes mutacions són delecions en l’exó 19 i una mutació puntual en la posició L858R de l’exó 21. Tot i així, més de la meitat dels pacients amb les mutacions de sensibilitat tractats amb ITQ recauen. Una de causes més comunes és l’aparició de la mutació de resistència T790M en l’exó 20. El mètode estàndard per estudiar alteracions genètiques és la seqüenciació Sanger. Com que la seva sensibilitat de detecció es situa al voltant del 20%, en aquest treball s’han optimitzat altres tècniques més sensibles, com l’anàlisi de fragments per detectar les delecions de l’exó 19 (GeneScan) i la discriminació al·lèlica per TaqMan per a les mutacions L858R i T790M en mostres de teixit tumoral inclòs en parafina i per a mostres amb poca cel·lularitat tumoral. A continuació, s’ha realitzat tant la validació analítica (límit de detecció; quantitat mínima d’ADN mutat necessària per detectar la mutació; sensibilitat, especificitat i repetibilitat de les tècniques, i estudi de l’heterogeneïtat de les mutacions dins el tumor) com la validació clínica (respostes al tractament, supervivència i PFS dels pacients amb mutació de l’Spanish Lung Adenocarcinoma Data Base (SLADB)). Aquesta validació ha permès l’aplicació d’aquestes tècniques en l’estudi de les mutacions dels pacients inclosos en l’assaig EURTAC (primer estudi realitzat amb pacients caucàsics mutats) i la seva relació amb la resposta, supervivència i PFS dels pacients tractats amb erlotinib respecte als tractats amb quimioteràpia convencional. Per una altra banda, l’obtenció de mostra de teixit inclòs en parafina no és viable en molts pacients avançats. Es va pensar en l’ADN circulant de la sang perifèrica com a font d’informació de l’estat mutacional del tumor ja que es pot obtenir d’una manera no agressiva del pacient i permet la seva monitorització al llarg del temps. Malgrat que els processos tumorals alliberen ADN al torrent sanguini, hi ha molts altres processos biològics que incrementen la concentració d’al·lels wild type (wt). Per tal de detectar aquesta baixa concentració d’al·lels mutats en sang perifèrica, s’han optimitzat les tècniques de GeneScan i TaqMan afegint la sonda PNA en les reaccions per inhibir l’amplificació dels al·lels wt. S’ha realitzat tant la validació analítica (límit de detecció; quantitat mínima d’ADN mutat necessària per detectar la mutació; sensibilitat, especificitat i repetibilitat de les tècniques) com la validació clínica (respostes al tractament, supervivència i PFS dels pacients mutats en sang perifèrica, de l’SLADB i l’EURTAC). S’ha comprovat que aquestes tècniques són adequades, no només en l’estudi de les mutacions en teixit inclòs en parafina sinó també en mostres de sang perifèrica, en obtenir-se resultats molt semblants als descrits en la bibliografia. / Non-small-cell lung cancer (NSCLC) is a major cause of death from cancer in the Caucasian population. Some clinical studies of tyrosine kinase inhibitors (TKIs) that target the epidermal growth factor receptor (EGFR) gene in patients with advanced NSCLC showed that some patients with clinical and pathological factors -such as female sex, adenocarcinoma histology (the most frequent histology in NSCLC) and never smoker status- experienced rapid responses. In 2004, it was reported that the presence of somatic mutations in the kinase domain of EGFR strongly correlates with increased responsiveness to EGFR TKIs. Two types of mutation, short in-frame deletions in exon 19 and the exon 21 point mutation L858R, have been reported to comprise up to 90% of all activating EGFR mutations. However, about half of patients with these activating mutations who present dramatic initial responses will eventually develop resistance to TKI treatment. Such resistance is associated with the secondary T790M resistance mutation in exon 20. Thus far, Sanger sequencing is the conventional method used for detection of mutations in tumor cells but its sensitivity is suboptimal for clinical tumor samples because it fails to detect mutations in samples with less than 20% mutated alleles. In this study, other methods have been tested such as fragment analysis to detect exon 19 in-frame deletions (GeneScan) and allelic discrimination by TaqMan assay to detect both exon 21 L858R and T90M exon 20 point mutations from formalin fixed paraffin embedded tissue and also from samples with few tumor cells. We performed analytical validation (detection limit, minimum amount of mutated DNA necessary for detection, sensitivity, specificity and repeatability of techniques, and tumor heterogeneity) and clinical validation (treatment response, survival and progression-free survival [PFS] of EGFR mutated patients from the Spanish Lung Adenocarcinoma Data Base [SLADB]. After a successful validation process, EGFR mutations were analyzed from patients in the EURTAC trial, which was the first randomized trial comparing erlotinib with platinum-based chemotherapy as first-line treatment in non-Asian patients with EGFR mutations; treatment response, survival and PFS were assessed. However, the difficulty to obtain tumor tissue, particularly from patients with advanced NSCLC, stimulated interest in analyses using surrogate samples, such as peripheral blood, which frequently contain circulating free DNA derived from tumor tissue. This circulating free DNA could be obtained by non-invasive procedures that allow for serial tumor sampling during lung cancer screening. Although tumor processes release DNA to the bloodstream, other biological and physiological mechanisms increase the concentration of wild-type (wt) alleles. There are several drawbacks that interfere with circulating free DNA mutation detection assays like the low frequency of the mutations that occur in the tumor, their poor release to the bloodstream and the dilution effect of DNA fragments and wt DNA. Genescan and TaqMan assay were optimized to detect EGFR mutations in peripheral blood samples using PNA probe to inhibit the amplification of wt alleles. We performed analytical validation (detection limit, minimum amount of mutated DNA necessary for detection, sensitivity, specificity and repeatability of techniques) and clinical validation (treatment response, survival and PFS of EGFR mutated patients in peripheral blood samples from the SLADB and EURTAC trials). The findings suggest that GeneScan and TaqMan assay are feasible means of determining EGFR mutational status in formalin fixed paraffin embedded tissue and peripheral blood samples of advanced NSCLC patients. The results obtained agree closely with those described in the literature.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/283945 |
| Date | 31 October 2014 |
| Creators | Queralt Herrero, Cristina |
| Contributors | Rosell Costa, Rafael, Tarón Roca, Miquel, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Medicina |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 303 p., application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.0046 seconds