Surfactant-Proteine (SP) sind von kritischer Bedeutung für die physiologische Atmung und besitzen vielfältige Verknüpfungen zur Genese pulmonaler Pathologien. Dagegen ist das Wissen über die Rolle von SP bei Erkrankungen des Gehirns begrenzt.
Surfactant-Protein-G (SP-G) als zuletzt bekanntgewordener Vertreter der SP-Familie wird vermutlich als hirneigenes und rheologisch aktives Protein in räumlicher Nähe zur Blut-Hirn-Schranke (BHS) exprimiert. Im Rahmen verschiedener akuter und chronischer zerebraler Pathologien werden die Bedeutung von SP-G-Profilveränderungen und seine möglichen regulatorischen Aufgaben in der zerebralen Flüssigkeitshomöostase bereits vielfältig diskutiert. Naheliegend ist eine räumliche und pathophysiologische Beziehung von SP-G zu Komponenten der Neurovaskulären Einheit (NVU) und zum glymphatischen System (GS) auch bei der fokalen zerebralen Ischämie. Dabei ist die Entwicklung neuer therapeutischer Angriffspunkte und die Überwindung des „translational roadblock“ gerade bei dieser Erkrankung von entscheidender Bedeutung für eine zukünftig bessere klinische Versorgung von Schlaganfall-Patient:innen.
Diese Studie stellt die erste räumliche und zeitliche Charakterisierung von SP-G zusammen mit vaskulären, glialen und neuronalen Komponenten der NVU nach fokaler zerebraler, Ischämie in verschiedenen Modellen in Maus, Ratte und Schaf dar. Im Zentrum der Untersuchungen standen immunfluoreszenzbasierte qualitative und quantitative Analysen ischämiebedingter Veränderungen von SP-G und dessen regionale Assoziationen zu Elementen der NVU an unterschiedlichen Zeitpunkten nach zerebraler Ischämie.
Mit dem Ziel einer verbesserten Übertragbarkeit wurden mehrere Spezies und Modelle berücksichtigt: ein Filamentmodell in der Maus, ein thromboembolisches Modell in der Ratte und ein koagulationsbasiertes Großtiermodell im Schaf. Um mögliche zeitabhängige Prozesse zu berücksichtigen, wurden mehrere postischämische Beobachtungspunkte gewählt mit einer Spannbreite von 4 h bis 72 h für die Nagermodelle und 14 d für das Schafmodell.
Qualitative Dreifach-Fluoreszenzfärbungen kortikaler und subkortikaler Hirnregionen zeigten SP-G als sensitiven Marker der Ischämie mit einem Verlust der Signalintensität sowie charakteristischen morphologischen Signalveränderungen über alle Zeitpunkte, Tiermodelle und Hirnregionen hinweg – in enger Assoziation zu ischämisch veränderten NVU-Elementen und Gefäßen.
Bildgestützte quantitative statistische Analysen der inter-hemisphäriellen, im Zusammenhang mit der Ischämie stehenden, Veränderungen der Fluoreszenzsignale von SP-G und dem ischämiesensitiven Basalmembranbestandteil Kollagen IV zu verschiedenen Zeitpunkten untersuchten die zeitliche Dynamik der qualitativen Signalveränderungen von SP-G eingehender. Im Mausmodell zeigte sich eine statistisch signifikante, verminderte SP-G-Immunreaktivität (Ir) in von der Ischämie betroffenen neo- und subkortikalen Hirnregionen, mit einem maximalen Verlust der Signalintensität im Infarktkern 4 h und 24 h nach fokaler zerebraler Ischämie. Beginnend in der ischämischen Grenzzone zeigte sich entlang des Neokortex ein gradueller Verlust der SP-G-Ir, bereits 4 h nach Insult mit zunehmender Effektstärke bei länger andauernder Ischämie von 24 h.
SP-G-Ir zeigte zwar keine direkte Überlappung mit dem Gefäßsystem, jedoch eine signifikante negative Korrelation zur invers erhöhten Kollagen IV-Ir in der Ischämie, die analog zu SP-G mit einem Maximum der Signalveränderungen im ischämischen Kerngebiet und gradueller Zunahme der Immunsignale über den Neokortex reagierte. Besonders für die ischämische Grenzzone präsentierte sich SP-G als frühzeitiger sensitiver Marker mit einem signifikanten Verlust der Immunmarkierung noch vor der Demarkierung des Infarkts durch erhöhte Kollagen IV-Ir ischämisch geschädigter Gefäße. Auch für subkortikale Regionen bestätigte sich die statistisch signifikante, negative Korrelation beider Marker in vergleichbarem Ausmaß.
SP-G zeigte im nicht von der Ischämie betroffenen Gewebe eine ausgeprägte peri-nukleäre neuronale Zellassoziation und homogene Expression im Neuropil der untersuchten Vorderhirne von Mäusen und Ratten. Im Zusammenhang mit dem ischämischen Insult resultierten zuverlässig Signalveränderungen von SP-G-Ir entlang der subkortikalen ischämischen Grenzzone. Auch war ein Verlust der parenchymatösen Neuropil-Färbung sowie der auffälligen peri-nukleären SP-G-Markierung in allen analysierten ischämischen Hirnregionen erkennbar.
Ischämiebedingte Veränderungen der SP-G-Ir gingen einher mit einer Störung der Permeabilitätsbarriere der BHS, bei der SP-G in enger räumlicher Beziehung zu extravasalem Serumalbumin detektiert wurde. Weitere Assoziation zu Komponenten der NVU zeigten sich im ischämiebedingten Signalverlust von SP-G bei gleichzeitigem Anstieg der CNP-Ir von Oligodendrozyten ebenso wie mit gemeinsamen ischämisch-morphologischen Veränderungen von Mikro- und Astroglia (visualisiert durch Iba- bzw. GFAP-Ir). Veränderungen von Aquaporin 4- und SP-G-Ir markierten in gleicher Weise die ischämische Grenzzone, von der aus sich ein Verlust der Fluoreszenzsignale beider Marker in der von maximaler Ischämie betroffenen Zone anschloss.
Die ermittelten ischämisch-morphologischen Signalveränderungen der NVU-Marker stimmten mit Beobachtungen früherer Untersuchungen überein. Trotz der engen räumlichen Assoziationen konnte eine sichere Ko-Expression von SP-G mit glialen oder Gefäß-Markern jedoch in keinem Tiermodell gezeigt werden – ein Aspekt, der durch Laserscanning-Mikroskopie verifiziert wurde. Die charakteristischen SP-G-Signalalterationen und ischämiebedingten Veränderungen der NVU im Filamentmodell der Maus bestätigten sich im thromboembolischen Modell der Ratte weitgehend. Untersuchungen im Großtiermodell des Schafs zeigten den Verlust der SP-G-Ir im Infarkt auch 14 d nach koagulationsbedingter Ischämieinduktion und verifizierten SP-G als Marker der Ischämie über einen langen post-ischämischen Zeitraum.
Kombinierte Immunmarkierungen von SP-G und Fibronektin zeigten eine regionale Assoziation ischämischer Veränderungen beider Marker und deuteten auf mögliche Verbindungen von SP-G zum extrazellulären Raum auch über klassische
NVU-Komponenten hinaus.
Die mutmaßlichen rheologischen Eigenschaften von SP-G, seine in früheren Untersuchungen gezeigte Präsenz in perivaskulären bzw. glymphatischen Räumen und bekannte Verknüpfungen zu pathologischen Veränderungen des Liquorsystems suggerierten im Vorfeld mögliche Verknüpfungen von SP-G und flüssigkeitsregulatorischen Systemen im Gehirn.
Die beobachteten ischämischen Veränderungen von SP-G sowie seine Assoziation mit vaskulären und glialen Komponenten der NVU weisen auf eine mögliche Beteiligung von SP-G an regulatorischen Aufgaben in der NVU hin, speziell im Kontext mit vaskulärer Integrität, Schutz des Endothels sowie Erhalt der Barrierefunktion der BHS. Eine Beteiligung von SP-G an der Flüssigkeitshomöostase und der Regulation von Fließeigenschaften scheint auch im ischämischen Parenchym denkbar – mit Implikationen im Hinblick auf das klinisch besonders relevante post-ischämische zerebrale Ödem. Die Assoziation von SP-G mit AQP4, sowie Hinweise auf eine Beteiligung in der Beseitigung von Abfallprodukten und der Regulation von Entzündungsreaktionen weisen auf SP-G als möglichen neuen Angriffspunkt in der Schlaganfalltherapie hin.
Allerdings ist die Ableitung funktioneller SP-G-Aspekte aus den größtenteils morphologischen Ergebnissen dieser Studie begrenzt und birgt die Gefahr der Überinterpretation von Daten. Weitere Limitationen sind die vorhandene Datenquantifizierung in nur einem Tiermodell sowie die auf die Immunfluoreszenz-mikroskopie beschränkte Methodik.
Zusätzliche Untersuchungen weiterer ischämierelevanter Marker, die Erweiterung von Tier- und Ischämiemodellen, die Untersuchung auch deutlich längerer oder transienter Ischämiezeiten sowie die Analyse humaner Proben werden nötig sein, um die Rolle von SP-G in der zerebralen Ischämie genauer einordnen zu können.
Insgesamt bietet die vorliegende Studie eine erste regionale und zeitliche Charakterisierung von SP-G nach experimenteller fokaler zerebraler Ischämie mit Hinweisen auf mögliche regulatorische Funktionen von SP-G im Rahmen der ischämisch veränderten NVU sowie der Flüssigkeitsregulation des Gehirns. Die Ergebnisse geben somit Anlass, SP-G im Kontext des ischämischen Schlaganfalls künftig noch eingehender zu untersuchen.:1 Abkürzungsverzeichnis 1
2 Einführung 3
2.1 Surfactant und Surfactant-Proteine 3
2.2 Surfactant-Proteine im Zentralen Nervensystem 5
2.3 Surfactant-Protein-G (SP-G) 6
2.4 Ischämischer Schlaganfall 8
2.5 Neurovaskuläre Einheit und Blut-Hirn-Schranke 12
2.6 Glymphatisches System und zerebrales Ödem 15
3 Zielsetzung 17
4 Material und Methoden 18
4.1 Material 18
4.1.1 Primärantikörper 18
4.1.2 Versuchstiere 19
4.2 Methoden 19
4.2.1 Ischämieinduktion und Tiermodelle 19
4.2.2 Gewebeaufarbeitung 21
4.2.3 Fluoreszenzmehrfachfärbungen 22
4.2.4 Histologische Kontrollen 24
4.2.5 Fluoreszenzmikroskopie 25
4.2.6 Bildgestützte Analyse und semiquantitative Auswertung 25
5 Ergebnisse 30
5.1 SP-G und Elemente des Gefäßsystems nach Ischämie in der Maus 30
5.1.1 Semiquantitative Analysen ischämischer Veränderungen von SP-G und Kollagen IV 37
5.2 SP-G und Komponenten der Neurovaskulären Einheit (NVU) nach Ischämie in der Maus 41
5.3 SP-G, Elemente des Gefäßsystems und der NVU nach Ischämie in der Ratte 46
5.4 SP-G und Elemente der NVU nach Ischämie im Schaf 51
6 Diskussion 53
6.1 SP-G und das Gefäßsystem in der Ischämie 53
6.2 Störungen der Blut-Hirn-Schranke und zerebrales Ödem 55
6.3 Aquaporin 4 und glymphatisches System 56
6.4 SP-G im Kontext von NVU und extrazellulärer Matrix 58
6.5 SP-G in verschiedenen Ischämiemodellen 60
6.6 Methodenbedingte Limitationen 61
7 Zusammenfassung 63
8 Literaturverzeichnis 67
9 Selbstständigkeitserklärung 79
10 Verzeichnis der wissenschaftlichen Veröffentlichungen 80
11 Danksagung 81
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:88912 |
| Date | 09 January 2024 |
| Creators | Reimann, Willi |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | https://doi.org/10.3390/ijms23115875 |
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