La fosfo-defosforilación de aminoácidos es uno de los procesos de regulación reversible más extendidos en los seres vivos. Este tipo de reacciones es llevado a cabo por la acción opuesta de las proteínas quinasas y las proteínas fosfatasas. A pesar de ello, el genoma de la levadura codifica un número mayor de Ser/Thr quinasas. Por ello, algunas fosfatasas han desarrollado un mecanismo de regulación distinto, que se basa en la unión de la subunidad catalítica a una o más subunidades reguladoras. Éstas determinan la localización subcelular, la especificidad por el sustrato y, en definitiva, la función de la fosfatasa. Éste es el caso de la fosfatasa de tipo 1, que está codificada por GLC7 en la levadura Saccharomyces cerevisiae, un enzima esencial que desarrolla funciones muy importantes en la biología de la célula y cuya función está regulada por la unión de la subunidad catalítica a multitud de subunidades reguladoras distintas.El genoma de la levadura codifica dos fosfatasas, conocidas con el nombre de Ppz1 y Ppz2 y cuya mitad carboxiterminal está relacionada estructuralmente con Glc7. A pesar de no ser esenciales, estas fosfatasas desarrollan un papel importante en la biología de la levadura Saccharomyces cerevisiae. En concreto, ejercen un control negativo sobre la tolerancia salina y la progresión del ciclo celular y positivo en el mantenimiento de la integridad celular. En el momento de iniciar este trabajo sólo se conocía una subunidad reguladora de estas fosfatasas, conocida con el nombre de Hal3 o Sis2. Esta proteína actúa como inhibidora de todas las funciones conocidas de Ppz1. Sin embargo, su mecanismo de actuación es desconocido.El primer objetivo de este trabajo ha sido intentar profundizar en la regulación que lleva a cabo la fosfatasa Ppz1 en el control del ciclo celular de la levadura. Para ello, se ha generado un doble mutante condicional sit4 hal3 que presenta una parada entre las fases G1 y S del ciclo. Esta cepa se ha transformado con dos genotecas multicopia diferentes. Gracias a ello se han podido aislar una serie de genes que, en multicopia son capaces de suprimir el fenotipo de esta cepa. Entre ellos se encuentran elementos reguladores del ciclo celular ya conocidos, algunas fosfatasas, elementos involucrados en homeostasis salina y tres genes cuya función era desconocida por el momento, que han sido renombrados VHS1, VHS2 y VHS3. En segundo lugar, se ha investigado el mecanismo de acción de Hal3 sobre la fosfatasa Ppz1. Para ello se han estudiado elementos hallados en la secuencia de Hal3 posiblemente relevantes para la función de esta proteína. Además, se ha realizado una estrategia de mutagénesis al azar de la zona más conservada de Hal3 seguida de una búsqueda de pérdida de función. Esto ha permitido hallar una serie cambios aminoacídicos únicos que interfieren en la función de Hal3. La caracterización bioquímica posterior ha permitido determinar dos regiones en la secuencia de Hal3 importantes para la unión a Ppz1 y una tercera región importante para inhibir a la fosfatasa.Finalmente, se ha estudiado el papel biológico de YFR003c, un ORF cuya función era desconocida por el momento. Estos estudios han demostrado que codifica una proteína con características afines a los inhibidores de la fosfatasa de tipo 1 humana. Además, se ha podido demostrar que Yfr003c es capaz de unirse e inhibir in vitro a Glc7 y, con menor eficiencia, a Ppz1. Estudios posteriores in vivo refuerzan la hipótesis del papel de Yfr003c como inhibidor de Glc7. Por este motivo, ha recibido el nombre de Ypi1 (Yeast Phosphatase 1 Inhibitor) y se ha propuesto como el primer inhibidor conocido de Glc7 en la levadura Saccharomyces cerevisiae. / Phospho-dephosphorylation of amino acids is one of the most extended mechanisms of reversible regulation found in living organisms. This kind of reactions is driven by the opposite action of kinases and phosphatases. In spite of this fact, yeast genome encodes more Ser/Thr protein kinases. For this reason some phosphatases have developed a different regulatory mechanism based on the union of the catalytic subunit to one or more regulatory proteins which in turn regulate the subcellular location, the specificity for substrate and thus, the function of the phosphatase. This is the case of Protein Phosphatase 1, encoded by the essential gene GLC7 in the yeast Saccharomyces cerevisiae. This enzyme plays an important role in the yeast and it is tightly regulated by the union of the catalytic subunit to different regulatory proteins.The genome of the yeast also encodes two phosphatases, named Ppz1 and Ppz2 that are structurally related to Glc7. Although they are not essential, they also play an important role in the biology of the yeast. These phosphatases act negatively in the control of the progression of cell cycle and in the maintenance of the salt tolerance and positively in the control of osmotic integrity. In the early steps of this work there was described only one regulatory subunit of these phosphatases named Hal3 or Sis2. Although its specific mechanism of function is still unknown it has been described that this protein acts as an inhibitor for all the known functions of Ppz1.In this work we tried to deepen in the regulation of the cell cycle progression driven by Ppz1. For this reason, we created a conditional sit4 hal3 double mutant, which presents, in non-permissive conditions, a blockade between the G1 and S phases of the cell cycle. This strain was transformed with two different multicopy libraries and colonies able to grow in non-permissive conditions were selected and plasmidic DNA extracted and sequenced. This procedure allowed us to identify a total of 13 genes that, when overexpressed, were able to suppress the phenotype of this strain under non-permissive conditions. They include well-known cell cycle regulatory elements but also some phosphatases, some genes that develop different roles in the control of salt tolerance and three genes with no known function until now that we renamed VHS1, VHS2 and VHS3. We also investigated the regulatory interaction between Hal3 and Ppz1. For this reason, we studied some elements found in the sequence of Hal3 that could be relevant for the function of this protein. Furthermore, we developed a strategy of random mutagenesis of the most conserved region of Hal3 followed by a screening of loss of function of the protein. This procedure allowed us to identify several amino acidic changes that affect Hal3 function in vivo. Biochemical characterization shows the presence of two regions in Hal3 that are important for the union to Ppz1 and a third one that is relevant in the inhibition of the phosphatase activity.Finally, we studied the biological role of YFR003c, an uncharacterized ORF with no known function. Our work demonstrated that YFR003c encodes a protein that shares characteristics commonly found in some inhibitors of the human protein phosphatase 1. We have shown that YFR003c is able to interact with Glc7 and Ppz1 in vitro. Furthermore, YFR003c acts as an inhibitor of Glc7 and, in a lesser degree, of Ppz1. Overexpression studies have shown that YFR003c can act in vivo as an inhibitor of Glc7. For this reason we renamed it YPI1 (for Yeast Phosphatase 1 Inhibitor) and it has been proposed to be the first endogenous inhibitor of Glc7 in the yeast Saccharomyces cerevisiae.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UAB/oai:www.tdx.cat:10803/3523 |
| Date | 03 December 2004 |
| Creators | Muñoz Muñoz, Ivan |
| Contributors | Ariño Carmona, Joaquín, Universitat Autònoma de Barcelona. Departament de Bioquímica i Biologia Molecular |
| Publisher | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Source Sets | Universitat Autònoma de Barcelona |
| Language | Catalan |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | application/pdf |
| Source | TDX (Tesis Doctorals en Xarxa) |
| Rights | ADVERTIMENT. L'accés als continguts d'aquesta tesi doctoral i la seva utilització ha de respectar els drets de la persona autora. Pot ser utilitzada per a consulta o estudi personal, així com en activitats o materials d'investigació i docència en els termes establerts a l'art. 32 del Text Refós de la Llei de Propietat Intel·lectual (RDL 1/1996). Per altres utilitzacions es requereix l'autorització prèvia i expressa de la persona autora. En qualsevol cas, en la utilització dels seus continguts caldrà indicar de forma clara el nom i cognoms de la persona autora i el títol de la tesi doctoral. No s'autoritza la seva reproducció o altres formes d'explotació efectuades amb finalitats de lucre ni la seva comunicació pública des d'un lloc aliè al servei TDX. Tampoc s'autoritza la presentació del seu contingut en una finestra o marc aliè a TDX (framing). Aquesta reserva de drets afecta tant als continguts de la tesi com als seus resums i índexs., info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.003 seconds