La enfermedad de Parkinson (EP) es el segundo trastorno neurodegenerativo más común en la población mundial. Esta patología es causada principalmente por la degeneración y muerte progresiva de las neuronas dopaminérgicas de la substantia nigra pars compacta (SNpc). La señalización celular en la EP ha sido y es uno de los aspectos más estudiados de la enfermedad, para tratar de comprender su etiopatogenia y encontrar nuevas dianas terapéuticas que permitan un tratamiento más específico de la enfermedad. Un componente clave en la muerte de las neuronas dopaminérgicas es el estrés oxidativo (EO), sin embargo, poco se sabe sobre el papel que juega la señalización mediada por las fosfolipasas D y A2 (PLD y PLA2, respectivamente) en este evento que inicia en etapas tempranas de la EP. El objetivo de este trabajo de tesis fue caracterizar el rol que cumplen las isoformas más importantes y estudiadas de las enzimas PLD y PLA2 en la respuesta neuronal frente al daño oxidativo. Para esto, se utilizaron como estímulo la 6-hidroxidopamina (6-OHDA) y la sobrecarga de hierro (Fe), dos agentes neurotóxicos ampliamente utilizados en el estudio de esta patología. La exposición neuronal a la 6-OHDA, un análogo hidroxilado de la dopamina, constituye una estrategia útil para estudiar los eventos moleculares asociados con la muerte neuronal en la EP. La 6-OHDA aumenta los niveles de oxidantes celulares y deteriora la cadena respiratoria mitocondrial, promoviendo así la lesión neuronal y la muerte. A pesar del uso extensivo de 6-OHDA en modelos animales, los eventos moleculares precisos desencadenados por este neurotóxico a nivel neuronal aún no se han dilucidado completamente. Las células de neuroblastoma humano IMR-32 expuestas a concentraciones crecientes de 6-OHDA mostraron altos niveles de especies reactivas de oxígeno (EROs) y
aumento de la permeabilidad de la membrana plasmática con disminución concomitante de la viabilidad celular. Como parte de la respuesta neuronal a la exposición a 6-OHDA, se observó la translocación de la subunidad p65 del factor nuclear potenciador de las cadenas ligeras kappa de las células B activadas (NF-κB) hacia el núcleo. La localización nuclear de NF-κB también fue acompañada por un aumento de la fosforilación del inhibidor de kappa B (IκB), así como por un aumento en los niveles de ARNm de la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y el receptor 4 de prostaglandina E2 (RP4). Aunque las vías canónicas que participan en la modulación de NF-κB se han descrito ampliamente, aquí se trabajó con la hipótesis de que la lesión inducida por 6-OHDA puede activar las vías de señalización de lípidos y, a su vez, modular la respuesta transcripcional. El EO generado en la célula por la 6-OHDA desencadenó la activación de vías de señalización de lípidos y produjo un aumento de los niveles de ácido fosfatídico (PA), diacilglicerol (DAG) y ácidos grasos libres en las células de neuroblastoma humano. La inhibición de la producción de PA pudo prevenir la disminución de la viabilidad celular provocada por 6-OHDA, la translocación nuclear de la subunidad p65 de NF-κB y el aumento en la expresión del ARNm de COX-2. En el primer capítulo de esta tesis, nuestros resultados indican que la respuesta neuronal desencadenada por 6-OHDA implica la activación de vías de señalización mediadas por PA que, a su vez, gobiernan la localización subcelular de NF-κB y la expresión de COX-2 de manera diferencial. La acumulación de Fe y la sobre-expresión de α-sinucleína son rasgos característicos de varios trastornos neurodegenerativos. Previamente en nuestro laboratorio hemos demostrado que el EO inducido por Fe activa la liberación de ácidos grasos catalizada por diferentes
isoformas de PLA2 en el sistema nervioso. En este trabajo, nuestro objetivo fue estudiar la participación de las PLA2 en la regulación de la biología de la α-sinucleína y en la respuesta neuronal a la sobrecarga de Fe. También investigamos el papel de los factores secretados por la glía en la resolución del daño oxidativo por parte de las neuronas. Se estudió el estado redox, la fosforilación de α-sinucleína y la participación de las isoformas de PLA2 citosólica e independiente de calcio (cPLA2 e iPLA2, respectivamente) en la regulación de estos eventos. Las neuronas IMR-32 expuestas a una sobrecarga de Fe, bajo la forma del compuesto denominado citrato amonio férrico (FAC), mostraron un aumento de los niveles de expresión de iPLA2, concomitantemente con un aumento de los peróxidos lipídicos y las EROs. El bloqueo farmacológico de la actividad de iPLA2 aumentó, aún más, los niveles de peróxidos lipídicos y el contenido de EROs. Por el contrario, la inhibición conjunta de cPLA2 e iPLA2 mostró el efecto opuesto al promover una disminución de los marcadores de EO asociados con una mayor viabilidad neuronal. Las neuronas estimuladas con Fe también mostraron un aumento de la fosforilación de α-sinucleína. La fosforilación de α-sinucleína fue bloqueada por la inhibición de la actividad de la iPLA2. Gran parte de estos resultados también fueron corroborados por estudios en la línea celular de neuronas dopaminérgicas de rata (N27). Para estudiar el papel de la glía en la respuesta neuronal al Fe, se expusieron las células de astroglioma C6 a FAC o su vehículo, y los medios derivados de los astrocitos incubados en estas condiciones se añadieron, luego, a cultivos neuronales. En la caracterización de los astrocitos expuestos a Fe, estos mostraron un aumento en el marcador glial S100β y en los niveles de peroxidación lipídica, indicando una reactividad al EO. Los astrocitos fueron positivos para γ-glutamilcisteína ligasa, enzima limitante de la reacción de biosíntesis de glutatión. La respuesta de las neuronas a los medios condicionados de los astrocitos fue diferente dependiendo del origen de la línea celular. Mientras que el medio condicionado de astrocitos demostró ser neuroprotector para las neuronas humanas IMR-32, el efecto contrario se observó en las células dopaminergicas N27 derivadas de mesencéfalo de rata. Los resultados del segundo capítulo de esta tesis muestran roles específicos para la iPLA2 en cuanto a la neuroprotección y modulación de la fosforilacion de α-sinucleína en la respuesta neuronal a la lesión inducida por Fe. En conjunto los hallazgos de este trabajo de tesis contribuyen a dilucidar nuevos mecanismos de acción de determinadas isoformas de la PLA2 y la PLD en procesos de injuria neuronal asociados con la EP. / Parkinson's disease (PD) is the second most common neurodegenerative disorder worldwide. This pathology is mainly caused by the degeneration and progressive death of the dopaminergic neurons of the substantia nigra pars compacta (SNpc). Cell signaling in PD has always been one of the most studied key aspects of the disease in an attempt not only to understand its etiopathogenesis but also to find new therapeutic targets towards a more specific treatment of this pathology. However, little is known to date about the role of phospholipase D and A2 signaling (PLD and PLA2, respectively) in the neuronal response to oxidative injury, beginning in the early stages of PD. The objective of this thesis work was to begin to delineate the role played by the most important and studied isoforms of PLD and PLA2 enzymes in the neuronal response to oxidative damage, when they were subjected to the stimulus of 6-hydroxydopamine (6-OHDA) and to iron overload (Fe), two neurotoxic agents widely used in the study of PD. Likewise, the relationship and impact of the latter on the biology of α-synuclein were figured.
Neuronal exposure to 6-OHDA, a hydroxylated analog of dopamine, is a useful strategy to study the molecular events associated with neuronal death in PD. 6-OHDA increases the levels of cellular oxidants and impairs the mitochondrial respiratory chain, thus promoting neuronal damage and death. Despite the extensive use of 6-OHDA in animal models, the exact molecular events triggered by this neurotoxic at the neuronal level have not yet been fully understood. Human IMR-32 neuroblastoma cells exposed to increasing concentrations of 6-OHDA showed high levels of reactive oxygen species (ROS) and increased plasma membrane permeability with concomitant decrease in cell viability.
As part of the neuronal response to exposure to 6-OHDA, the translocation to the nucleus of the p65 subunit of the nuclear factor enhancer of the kappa light chains of activated B cells (NF-κB) was observed. The nuclear localization of NF-κB was also accompanied by an increase in phosphorylation of the inhibitor of kappa B (IκB) as well as an increase in the levels of mRNA of cyclooxygenase-2 (COX-2) and prostaglandin E2 receptor 4 (RP4). Although the canonical pathways involved in NF-κB modulation have been extensively described, the hypothesis that 6-OHDA-induced injury can activate lipid signaling pathways and, in turn, modulate the transcriptional response has been challenged here. The oxidative stress generated in the cell by 6-OHDA triggered the activation of lipid signaling pathways and produced an increase in the levels of phosphatidic acid (PA), diacylglycerol (DAG) and free fatty acids in human neuroblastoma cells. Inhibition of PA production could prevent the decrease in cell viability caused by 6-OHDA, the nuclear translocation of the p65 subunit of NF-κB and the increase in the expression of COX-2 mRNA. Our results indicate that the initiation of the inflammatory process triggered by 6-OHDA involves the activation of PA signaling which, in turn, governs the subcellular localization of NF-κB and the expression of COX-2 mRNA.
Iron accumulation and α-synuclein overexpression are characteristic features of several neurodegenerative disorders. We have previously shown in our laboratory that oxidative stress induced by Fe activates the release of fatty acids catalyzed by different isoforms of PLA2 in the nervous system. In this work, our objective was to study the participation of PLA2 in the regulation of α-synuclein biology and the redox response developed by neurons in response to Fe overload. We also investigated the role of factors secreted by the glia in the resolution of oxidative damage by neurons. The redox state, the phosphorylation of α-
synuclein and the participation of the calcium-dependent and independent PLA2 isoforms (cPLA2 and iPLA2, respectively) in the regulation of these events were studied. IMR-32 neurons exposed to Fe overload, in the form of the compound called ferric ammonium citrate (FAC), showed an increase in iPLA2 expression levels, concomitantly with an increase in lipid peroxides and ROS. The pharmacological blocking of iPLA2 activity further increased the levels of lipid peroxides and the content of ROS. In contrast, cPLA2 inhibition showed the opposite effect by promoting a decrease in oxidative stress markers associated with higher neuronal viability. Fe-stimulated neurons also showed increased α-synuclein phosphorylation. The phosphorylation of α-synuclein was blocked by the inhibition of iPLA2 activity. Several of these results were also corroborated by studies in the rat dopaminergic neuron cell line (N27).
To study the role of glia in the neuronal response to Fe, C6 astroglioma cells were subjected to FAC or vehicle, and astrocyte-derived media was added to neuronal cultures of the same species (N27). In the characterization of the astrocytes exposed to Fe, they showed an increase in the glial marker S100β and the levels of lipid peroxidation, indicating a reactivity to oxidative stress. Neurons incubated with the above-mentioned astrocyte-derived media showed higher levels of oxidative damage than neurons exposed solely to Fe. Astrocytes were positive for the rate-limiting step enzyme for glutathione biosynthesis. Taken together, our results show specific roles for iPLA2 in terms of neuroprotection and modulation of α-synuclein phosphorylation in the neuronal response to Fe-induced injury.
Together, the results of this thesis work contribute to elucidate new mechanisms of action of certain isoforms of PLA2 and PLD in neuronal injury processes associated with PD.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uns.edu.ar/oai:repositorio.bc.uns.edu.ar:123456789/5586 |
| Date | 19 April 2021 |
| Creators | Iglesias González, Pablo Andrés |
| Contributors | Salvador, Gabriela Alejandra, Uranga, Romina María |
| Publisher | Universidad Nacional del Sur |
| Source Sets | Universidad Nacional del Sur |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Electronic Thesis or Dissertation, Text |
| Format | application/pdf |
| Rights | 2 |
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