Introdução: Os lisossomos são organelas ácidas em que muitos tipos de macromoléculas, incluindo proteínas, carboidratos, ácidos nucléicos e lipídios são entregues para a degradação. A biogênese dos lisossomos requer a contínua substituição das enzimas lisossomais solúveis e das proteínas de membrana lisossomal. O direcionamento das hidrolases ácidas depende dos resíduos de manose-6-fosfato (M6P) que são reconhecidos por receptores específicos que medeiam o seu transporte para os lisossomos. O papel chave na formação destes resíduos é desempenhado no Complexo de Golgi pela enzima GlcNAc-1-fosfotransferase que contêm seis subunidades, α2β2γ2. Este complexo enzimático é codificado por dois genes, GNPTAB e GNPTG. Mutações nestes genes resultam em duas doenças lisossômicas, as mucolipidoses (ML) tipo II e III, caracterizadas bioquimicamente pela perda de múltiplas enzimas lisossomais, devido à formação deficiente dos resíduos de M6P. Objetivos: 1) Verificar a patogenicidade, por meio de ensaios in vitro, das seguintes mutações em GNPTAB previamente identificadas em pacientes brasileiros com ML II e III alfa/beta: c.1208T>C, c.1514G>A, c.1723G>A, c.1759C>T, c.1931_1932CA>TG, c.2269_2273delGAAAC, c.2808A>G e c.3668_3670delCTA; 2) Caracterizar o perfil de mutações de GNPTG presente em uma amostra de pacientes com ML III gama; 3) Analisar o efeito de gentamicina e cloranfenicol sobre a atividade das enzimas α-manosidase, β-glicuronidase e β-galactosidase em fibroblastos de pacientes com ML III gama heterozigotos ou homozigotos para mutações sem sentido em GNPTG. Metodologia: Estudo transversal, amostragem por conveniência, incluindo pacientes com diagnóstico clínico e bioquímico de ML II/III. Mutações em GNPTAB previamente identificadas em pacientes brasileiros com ML II/III alfa/beta foram estudas em relação a expressão de mRNA, proteína, atividade enzimática e localização intracelular da GlcNAc-1-fosfotransferase. Pacientes também foram avaliados quanto a variações no gene GNPTG e seus possíveis impactos a nível de mRNA. O grupo de pacientes com ML III gama foram avaliados para medir sua independência funcional “Functional Independence Measure” (FIM). Estudos de expressão de GNPTAB e GNPTG também foram desenvolvidos para maior compreensão da relação destes genes. O desenvolvimento de um possível tratamento realizado nos fibroblastos de pacientes com ML III gama também foram objeto de estudo. Resultados: Mutações sem sentido e que alteram a fase de leitura da enzima GlcNAc-1-fosfotransferase não são corretamente transportados do retículo endoplasmático (RE) ao aparelho de Golgi, devido a interrupção, a falta dos sinais de exportação localizados nas porções N- e C- terminais da proteína. O não transporte ao Golgi e consequentemente, a ausência da clivagem proteolítica da proteína precursora das subunidades α/β, são responsáveis pela falta de atividade enzimática. Além dessas, mutações com sentido trocado na porção luminal da enzima também podem ter o transporte ao Golgi prejudicado, o que sugere a presença de um local de contato para uma proteína necessária para a exportação eficiente do RE. O estabelecimento de um ensaio radioativo para medir a atividade enzimática da GlcNAc-1-fosfotransferase confirmou que o transporte para o Golgi e a clivagem proteolítica nas subunidades α- e β- maduras é um pré-requisito para a atividade enzimática. As mutações em GNPTAB tiveram sua patogenicidade confirmada. Em relação a análise de GNPTG, as técnicas moleculares empregadas permitiram a identificação de três novas mutações patogênicas (c.244_247dupGAGT, c.328G>T e c.233+5G>C) e de uma outra variação (c.-112C>G). Após incessante investigação do trio cuja mutação causal c.244_247dupGAGT foi encontrada, a mesma foi atribuída como um evento de novo que ocorreu em um único óvulo ou de um mosaicismo germinativo no óvulo materno. Ao investigar o potencial efeito das mutações sem sentido através de mRNA, não foi possível identificar a mutação c.328G>T (p.E110X), no lugar desta, todos os pacientes apresentaram a sequência selvagem de GNPTG, evento denominado edição de RNA (c.328G@T). Porém, níveis de mRNA muito próximos a zero foram obtidos o que confirma a patogenicidade das mutações em GNPTG bem como o diagnóstico dos pacientes. Em pacientes ML II e III alfa/beta e em ML III gama, a redução dos níveis de mRNA de GNPTAB e GNPTG, respectivamente, pode ser facilmente explicada pela natureza das mutações identificadas nos pacientes. O que intriga, porém, é a expressão do gene não mutado. A divergência entre os resultados encontrados pode estar relacionada ao tipo de amostra, sabendo-se que as ML II e ML III são tecido-específicas. Fibroblastos de três pacientes com ML III gama portadores de mutações sem sentido foram tratados com geneticina e cloranfenicol. Este estudo de conceitos não demonstrou a possibilidade ou eficácia de um tratamento ser desenvolvido baseado na utilização de compostos não antibióticos atuarem sobre a tradução alternativa ou read through em pacientes com ML II e III. Conclusão: Estudos de caracterização genética, clínica e populacional sempre contribuirão para a elucidação dos mecanismos da doença e concomitantemente, melhor atendimento ao paciente. Com isto, é de grande importância que esforços e recursos sejam destinados a pesquisas nesta área para o completo entendimento das ML II e III e dos processos biológicos envolvidos. Este é o primeiro estudo brasileira a realizar o diagnóstico molecular de ML III gama; o primeiro a relatar uma mutação de novo e também, a ocorrência de edição de mRNA em pacientes com ML III gama. / Introduction: Lysosomes are acidic organelles into which many types of macromolecules including proteins, carbohydrates, nucleic acids and lipids are delivered for degradation. The biogenesis of lysosomes requires a continuous substitution of soluble lysosomal enzymes and lysosomal membrane proteins. The targeting of lysosomal enzymes depends on mannose 6-phosphate residues (M6P) that are recognized by M6P-specific receptors mediating their transport to lysosomes. The key role in the formation of M6P residues plays the Golgi-resident GlcNAc-1-phosphotransferase complex consisting of six subunits, α2β2γ2. This enzyme complex is encoded by two genes, GNPTAB and GNPTG. Mutations in these genes result in two lysosomal storage diseases, mucolipidosis (ML) type II and III, biochemically characterized by the missorting of multiple lysosomal enzymes due to impaired formation of M6P residues, and general lysosomal dysfunction. Objectives: 1)To analyze the pathogenicity, through in vitro tests, of GNPTAB mutations previously identified in Brazilian patients with ML II and III alpha/beta: c.1208T>C, c.1514G>A, c.1723G>A, c.1759C>T, c.1931_1932CA>TG, c.2269_2273delGAAAC, c.2808A>G and c.3668_3670delCTA; 2) Characterize GNPTG mutational profile in a ML III gamma patients group; 3) Analyze the effect of gentamicin and chloramphenicol on the activity of α-mannosidase, β-glucuronidase and β-galactosidasein fibroblasts of ML III gamma patients with GNPTG nonsense mutations. Methods: Cross-sectional study, with convenience sample, including patients with a clinical and biochemical diagnosis of ML II/III. GNPTAB mutations previously identified in ML II/III alpha/beta Brazilian patients were studied in relation to mRNA and protein expression, enzyme activity and intracellular localization of GlcNAc-1-phosphotransferase. Patients were also evaluated to GNPTG variations and possible mRNA impacts. The ML III gamma patients group was also evaluated with the Functional Independence Measure (FIM). GNPTAB and GNPTG expression studies were developed to better understand the relationship between them. Geneticin and chloramphenicol were used to treat ML III gamma fibroblasts. Results: Nonsense and frameshift mutations of GlcNAc-1-phosphotransferase failed to reach the Golgi apparatus due to the interrupted cooperative ER export signals localized both in the N- and C-terminal cytosolic tails and lacked proteolytic activation of the α/β-subunit precursor. In addition, luminal missense mutations of the GlcNAc-1-phosphotransferase can also impair the transport to the Golgi apparatus, suggesting the presence of a protein contact site required for efficient ER export. The establishment of a radioactive assay to measure the activity of the GlcNAc-1-phosphotransferase confirmed that the transport to the Golgi and proteolytic cleavage into mature α- and β-subunits is prerequisite for enzymatic activity. Regarding GNPTG analysis, molecular techniques employed allowed the identification of three new pathogenic mutations (p.F83X, p.E110X, c.233+5G>C) and another variation (c.-112C>G). After research, p.F83X was attributable to a de novo event which occurred in only one ovum, or to germline mosaicism in the mothers’ ova. The potential effect of p.E110X mutation in mRNA was investigated. However it was not possible to identify transcripts carrying this mutation since all patients appear to present only the wild type sequence, an event called mRNA editing (c.328G@T). Nevertheless, low mRNA levels confirm the GNPTG mutations pathogenicity and the patients’ diagnosis. In ML II/III alpha/beta and ML III gamma patients, low GNPTAB and GNPTG mRNA expression levels, respectively, can easily be explained by the nature of the mutations. Interestingly, it is the non-mutated gene. Divergence between results may be related to the type of sample, given that ML II and III are tissue-specific diseases. Fibroblasts from three ML III gamma patients were treated with geneticin and chloramphenicol with no effect being observed. This pilot study does not support the feasibility or effectiveness for the development of a treatment based on the use of non-antibiotic compounds acting on the read through of either ML II or III patients. Conclusions: Genetic, clinical and population characterization studies always contribute to the elucidation of disease mechanisms and concomitantly, lead to better patient care. It is very important that efforts and resources to be focused in this area for the complete understanding of ML II and III as well as the biological processes involved. This is the first study to perform molecular diagnosis in ML III gamma Brazilian patients. Also it is the first to report a de novo mutation and the occurrence of mRNA editing in ML III gamma patients.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:lume.ufrgs.br:10183/119620 |
| Date | January 2014 |
| Creators | Velho, Renata Voltolini |
| Contributors | Schwartz, Ida Vanessa Doederlein, Matte, Ursula da Silveira |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFRGS, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Sul, instacron:UFRGS |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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