Quantifizierung des postmortalen RNA-Status im Gehirn mittels Real-time-PCR: Ein Beitrag zur Bestimmung der Leichenliegezeit Der postmortale Nukleinsäureabbau verläuft unterschiedlich: während DNA im Allgemeinen als stabil angesehen wird und erst mit Einsetzen von Fäulniserscheinungen stärkerer Degradation unterliegt, wird RNA mit dem Sistieren der Kreislauftätigkeit relativ rasch abgebaut. Eine Reihe von Studien hat aber gezeigt, dass RNA in bestimmten Geweben eine höhere Stabilität besitzt als ursprünglich angenommen. Dies könnte Bedeutung für die molekulare Medizinforschung besitzen, die auf Genexpressionsstudien in postmortalem Gewebe angewiesen ist. Außerdem könnte eine Quantifizierung der RNA-Degradation z.B. durch Real-time-PCR zur Eingrenzung der Leichenliegezeit genutzt werden. In dieser Studie wurde ein quantitativer Vergleich verschiedener sog. Haushaltsgene (u.a. GAPDH, ß-Actin, FASN) in Gehirngewebe mit einer Leichenliegezeit zwischen 0 und 96 Stunden und unter alternativen Ansätzen zur reversen Transkription (oligo-(dT)-Primer mit und ohne sog. Anker, Random Hexamer Primer) durchgeführt. Zunächst erfolgten systematische Untersuchungen zur Effektivität der RNA-Isolierung, reversen Transkription und der PCR im Hinblick auf eine möglichst präzise Quantifizierung. Es zeigte sich, dass die Resultate der Real-time-PCR ein Maß für die ursprünglich in der Probe vorhandene mRNA-Menge darstellen. Weiterhin stellte sich heraus, dass eine deutliche und evtl. auch zur Liegezeitbestimmung nutzbare RNA-Degradation erst nach 24h einsetzt. Ein wesentlicher Unterschied zwischen Random- und oligo-(dT)-priming der reversen Transkription war dabei nicht festzustellen. Diese Ergebnisse belegen zum einen, dass RNA im frühen postmortalen Intervall relativ stabil ist und als Substrat für quantitative Untersuchungen dienen kann, zum anderen, dass ein zeitabhängiger Abbau besteht, der eine Eingrenzung der Leichenliegezeit z.B. mittels Grenzwerten in ein frühes und mittleres Postmortalintervall zulässt. / Quantification of the postmortem RNA-status in human brain by means of real-time-PCR: A contribution to the determination of the postmortem interval The postmortem degradation of nucleic acid proceeds differently: whereas DNA is generally considered as stable and is only subject to stronger degradation with the beginning of putrefaction, RNA degrades very fast when the circulation is suspended. A series of studies, however, has shown that RNA has a greater stability in certain tissues than originally expected. This could be important for molecular medical research which is dependent on gene expression studies using postmortem tissue. Furthermore, the quantification of RNA-degradation by means of real-time-PCR could be used for the limitation of the postmortem interval. In this study, a quantitative comparison has been made between different so-called housekeeping-genes (e.g. GAPDH, ß-Actin, FASN) in human brain and a postmortem interval between 0 and 96 hours. Different alternative approaches have been used for the reverse transcription (oligo-(dT)-Primer with and without Anker, Random Hexamer Primer). At first, systematic examinations concerning the effectiveness of RNA isolation, reverse transcription and PCR have been undertaken with regard to a preferably exact quantification. It turned out that the results of the real-time-PCR represent a measure for the mRNA amount originally present in the specimen. Moreover, it emerged that a clear RNA degradation, which could possibly be used for the determination of the postmortem interval, begins after 24 hours. An important difference between random and oligo-(dT) priming of the reverse transcription could not be stated. These results demonstrate, on the one hand, that RNA is relatively stable during the early postmortem interval so that it can serve as substrate for quantitative examinations. On the other hand, it is shown that a time-dependent degradation exists which allows a limitation of the postmortem interval into an early and middle postmortem interval by means of threshold values for example.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:uni-wuerzburg.de/oai:opus.bibliothek.uni-wuerzburg.de:2449 |
| Date | January 2008 |
| Creators | Walter, Christina |
| Source Sets | University of Würzburg |
| Language | deu |
| Detected Language | German |
| Type | doctoralthesis, doc-type:doctoralThesis |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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