O imprinting genômico, processo regulado epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua origem parental, está envolvido no crescimento e desenvolvimento placentário. Na região 11p15.5 encontram-se vários genes regulados por duas regiões controladoras de imprinting (ICR1 e ICR2), onde se encontram as regiões diferencialmente metiladas H19DMR e KvDMR1. Acredita-se que o padrão de imprinting seja dinamicamente regulado durante o desenvolvimento da placenta. Em humanos, há poucas informações sobre imprinting genômico e desenvolvimento placentário, principalmente para estágios precoces do desenvolvimento devido às dificuldades técnicas de obtenção dessas placentas. A descrição de mosaicismo do padrão de metilação restrito a placenta ou entre a placenta e o feto evidencia um perfil epigenético único deste órgão. A 5-hidroximetilação, a qual não tem um papel de silenciamento gênico, pode ser confundida com a metilação do DNA nas análises moleculares. O objetivo principal do presente estudo foi o de verificar a influência da idade gestacional (IG) no perfil de metilação do DNA das ICRs 1 e 2 em vilosidade coriônica, bem como a existência de mosaicismo do perfil de metilação intra-placentário. Neste trabalho também foi investigada a presença de hidroximetilação na KvDMR1. Foram coletadas amostras de tecido placentário, sendo 25 de vilosidades coriônicas (VC) (15 de 3° trimestre gestacional e 10 do 1° trimestre) e nove de cordão umbilical (UC) de 1° trimestre (pareadas com a VC). Quatro placentas de 3° trimestre foram analisadas em separado para o estudo de mosaicismo. O perfil de metilação do DNA das regiões foi verificado por PCR Específica para a Metilação (MS-PCR), Análise Combinada de Bissulfito e Restrição Enzimática (COBRA) e Método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real (DESM-RT), além do ensaio para hidroximetilação na KvDMR1. Com os ensaios qualitativos (MS-PCR e COBRA) foi observado um perfil de metilação monoalélico, sendo que na H19DMR foi identificada a presença de CpGs diferentemente metilados. Para a H19DMR foram observadas médias de 0,43 de metilação em VC e 0,31 em UC de 1° trimestre, e de 0,41 em VC de 3° trimestre. Para a KvDMR1, foram encontradas médias de 0,47 em VC e 0,57 em UC de 1° trimestre, e de 0,41 em VC de 3° trimestre. A presença de hidroximetilação na KvDMR1 foi excluída. Não foram observadas diferenças significativas entre as médias das diferentes IGs ou entre tecidos pelos testes t e F para ambas as regiões. Não foi observada correlação positiva no perfil de metilação para H19DMR e KvDMR1 entre os tecidos. Em relação ao mosaicismo, não houve diferenças significativas no perfil de metilação entre os diferentes cotilédones amostrados numa mesma placenta. Os resultados demonstram uma discordância entre tecido embrionário (UC) e extraembrionário (VC). Apesar de não serem observadas alterações significantes nos perfis de metilação da H19DMR e KvDMR1 em diferentes IGs, as informações apresentadas são importantes para as pesquisas sobre a dinâmica do fenômeno de imprinting genômico ao longo da gestação, para os estudos de mosaicismo intraplacentário bem como o perfil epigenético da placenta em relação a outros tecidos. / Genomic imprinting, an epigenetically regulated process by which genes are expressed accordingly to their parental origin, is involved in placental growth and development. In 11p15.5 region, there are many genes regulated by two Imprinting Control Regions (ICR1 and ICR2), in which are found two Differentially Methylated Regions, H19DMR and KvDMR1, respectively. Imprinting patterns seem to be adjusted during placenta development. In humans, there is little information on genomic imprinting and placental development, especially for early stages of development due to technical difficulties in obtaining these placentas. The description of mosaicism in methylation pattern restricted to placenta or between placenta and fetus shows a unique epigenetic profile of this organ. The 5-hidroxymethylation, which has no role in gene silencing, can be confused with DNA methylation in molecular analysis. The main aim of our study was to verify the influence of gestational age (GA) in DNA methylation profile of ICRs 1 and 2 in chorionic villi, as well as the existence of intra-placental methylation profile mosaicism. The presence of hydroximethylation in the KvDMR1 was also investigated. Samples were collected from placentas, 25 from chorionic villi (CV) (15 of the 3rd gestational trimester and 10 of the 1st trimester) and nine from umbilical cord (UC) in 1st trimester (paired with the CV samples). Four 3rd trimester placentas were separately analyzed for mosaicism. DNA methylation profile was verified by Methylation Specific PCR (MS-PCR), and Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) and Methylation-Sensitive Enzyme Digestion Method associated with Real-Time PCR (DESM-RT), in addition to hydroximethylation test in the KvDMR1 region. With qualitative assays (MS-PCR and COBRA), it was observed a monoallelic methylation pattern, and, only for the H19DMR, differently methylated CpGs were observed. For the H19DMR, we observed methylation means of 0.43 in CV and 0.31 in UC of 1st trimester, and 0.41 in CV of 3rd trimester. For KvDMR1, we observed means of 0.47 in CV and 0.57 in UC of 1st trimester, and 0.41 in CV of 3rd trimester. No hydroximethylation in the KvDMR1 was observed. There were no significant differences between the means of different GAs or between tissues by F and t tests for both regions. No positive correlation was found on methylation profile for H19DMR and KvDMR1 between tissues. In relation to mosaicism, there were no significant differences in methylation profile between different cotyledons sampled in the same placenta. The results showed a discrepancy between embryonic (UC) and extra-embryonic (CV) tissues. Although it was not observed significant changes in methylation profiles of H19DMR and KvDMR1 in different GAs, the presented results are important to research on dynamics of genomic imprinting phenomenon during pregnancy, studies of intra-placental mosaicism and placenta epigenetic profile in relation to other tissues.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-29102014-164207 |
| Date | 18 September 2012 |
| Creators | Leite, Sarah Blima Paulino |
| Contributors | Ramos, Ester Silveira |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Dissertação de Mestrado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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