Orientador: Prof. Dr. Ricardo Pasquini / Co-orientadora: Drª. Noemi Farah Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Federal do Paraná, Setor de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Medicina Interna. Defesa : Curitiba, 07/10/2014 / Inclui referências / Resumo: Anemia de Fanconi (AF) é uma doença autossômica recessiva e, em raros casos, ligada ao X, com grande heterogeneidade genética resultante de diferentes mutações em genes cujos produtos estão envolvidos nas vias de reparo do DNA, sendo que 16 subtipos genéticos já foram identificados. A variabilidade fenotípica desta doença dificulta o diagnóstico clínico, sendo necessários testes laboratoriais para sua confirmação. A possível influência do genótipo AF nas manifestações clínicas, como falência progressiva da medula óssea, leucemias e câncer, pode ser melhor definida se a mutação dentro de um subtipo genético for identificada. A pesquisa de mutações é complexa em função do número de genes associados e da variedade de alterações deletérias e não deletérias em cada gene. Os objetivos deste estudo foram identificar o subtipo genético dos pacientes brasileiros com AF, desenvolver uma estratégia de diagnóstico molecular aplicável à rotina clínica e correlacionar os genótipos encontrados com os fenótipos observados. Foram incluídos 255 pacientes AF, atendidos no ambulatório de Anemia de Fanconi do HC/UFPR, entre 1995 e 2012. Foi desenvolvido um teste de triagem para a identificação de 11 mutações frequentes nos genes FANCA, FANCC e FANCG dos pacientes AF brasileiros. Nos casos identificados somente em heterozigose a segunda mutação envolvida foi investigada pela técnica de MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification) e (ou) sequenciamento do DNA. Utilizando o teste de triagem proposto foi possível identificar alterações em 128 dos 255 pacientes (50,2%). Foram encontradas mutações no FANCA em 89/255 pacientes, no FANCC em 11/255 e no FANCG em 28/255. Em 71/128 pacientes foram encontradas mutações em homozigose e em 57/128 em heterozigose composta. Em quatro destes 57 a segunda mutação foi identificada ainda na triagem, em 51/57 foi necessário utilizar o MLPA e sequenciamento, e em dois pacientes não foi identificada a segunda mutação. Um total de 52 mutações diferentes foi encontrado, sendo 22 novas alterações ainda não descritas na literatura. O método proposto foi eficiente, pois permitiu a subtipificação genética de 126/255 (49,4%) pacientes. O uso desta estratégia possibilitou diminuir em 29,4% a necessidade do sequenciamento, além de dirigi-lo para um único gene em 20,0% dos casos heterozigotos. A redução do custo e do tempo torna viável a pesquisa de mutações como ferramenta para diagnóstico molecular da AF entre brasileiros. A análise da associação das mutações c.3788-3790delTCT e c.1077-2A>G com o fenótipo e às manifestações clínicas se restringiu aos dados disponíveis, porém foi limitada pelas dificuldades inerentes ao conteúdo dos prontuários. O uso desta estratégia de tipificação molecular em um maior número de pacientes permitirá a investigação mais ampla do efeito destas mutações na evolução clínica da AF. Palavras-chave: Anemia de Fanconi. Mutação-genética. Genes AF. / Abstract: Fanconi Anemia (FA) is an autosomal recessive or X-linked disease, with wide genetic heterogeneity resulting from different mutations in genes which products are involved in DNA repair pathways and 16 genetic subtypes have been identified. The phenotypic variability makes clinical diagnosis difficult and laboratory tests are necessary for confirmation. The possible influence of genotype in clinical manifestations such as progressive bone marrow failure, leukemia and cancer may be better understood if the mutations within a genetic subtype are identified. The mutation's investigation is complex due to the number of associated genes and the variety of deleterious and non-deleterious mutations in each gene. The aims of this study were to identify genetic subtypes of Brazilian patients with FA, to develop a strategy for molecular diagnosis applicable to clinical routine, and to correlate genotypes with phenotypes. 255 patients from Fanconi Anemia Outpatient Clinic of HC/UFPR, from 1995 to 2012 were included. The initial strategy was a screening test which included eleven frequent mutations in FA Brazilian patients. In the heterozygous cases the second mutation was investigated by MLPA (Multiplex Ligation Probe Amplification), and/or DNA sequencing. Using the proposed screening test, mutations were identified in 128 out of 255 patients (50.2%). FANCA mutations were found in 89/255 patients, FANCC in 11/255 patients and FANCG in 28/255 patients. 71/128 patients showed homozygous mutations and 57/128 were found in heterozygosis. In four out of 57 heterozygous the second mutation was identified in the screening test, in 51/57 MLPA and sequencing were required. In two patients the second mutation involved was not identified. A total of 52 different mutations were found, 22 of them are new mutations not previously described. The proposed method was effective because it allowed the genetic subtyping of 126/255 (49.4%) patients. Using this strategy a 29.4% decrease in sequencing demand was observed as well as sequencing was driven to a single gene in 20.0% when heterozygous. Cost and time reduction makes it feasible to search for mutations as a tool for molecular diagnosis of FA Brazilian patients. Analysis of association of the mutations c.3788_3790delTCT and c.1077-2A> G with the phenotype and the clinical manifestations was restricted to the available data, but limited by the difficulties relative to the content of the medical records. The use of this molecular typing strategy in a larger number of patients will allow more extensive investigation of the effect of these mutations in the clinical evolution of FA. Keywords: Fanconi Anemia. Genetic Mutation. FA genes.

Orientador: Denise Pontes Cavalcanti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-04T02:20:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lucon_DanielleRibeiro_M.pdf: 2254166 bytes, checksum: 614aec1320ad4a53e11d0565909047cd (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A associação entre anomalias cromossômicas, especialmente de aneuploidias e defeito do tubo neural (DTN) é bem conhecida, principalmente se o DTN é associado com outra malformação. Recentemente, estudos em modelos animais, utilizando a técnica de hibridização in situ com fluorescência (FISH), identificaram aneuploidias em tecido nervoso. Com o objetivo de verificar a freqüência e a possível ocorrência de anormalidade cromossômica restrita ao tecido cérebro-vascular (CV) em fetos e recém-nascidos com DTN, foram utilizadas técnicas de citogenética convencional em linfócitos e tecido CV, e análise desse por FISH-Multiprobe. A análise pelo FISH foi realizada em 10 recém-nascidos normais a fim de estabelecer o intervalo de confiança (IC) dos sinais diplóides. Foram avaliados 41 casos de DTN, que foram divididos em 3 grupos, de acordo com a amostra coletada e estudo citogenético: 1) grupo com cariótipo de linfócitos e de tecido CV, 13 casos; 2) grupo com cariótipo de tecido cérebro-vascular, 5 casos; e 3) grupo de pacientes com cariótipo de linfócitos, 23 casos. No grupo 1, três pacientes apresentaram cariótipo anormal restrito ao tecido CV: mos 92,XXYY/46,XY, mos 92,XXXX/46,XX, monossomia do cromossomo 6 em mosaico, representando dois casos de espinha bífida e um caso de anencefalia, respectivamente. A freqüência de anomalias cromossômicas nesse estudo foi de 6%. Foi possível observar uma maior porcentagem de aneuploidias restritas ao tecido CV. A porcentagem de aneuploidias encontradas neste tecido foi de 15% quando estudados por citogenética convencional e de 25% quando analisados por FISH. No grupo 2, todos os casos apresentaram cariótipo normal. No grupo 3, dois casos de anencefalia apresentaram cariótipo anormal: chi 47,XY,+21/46,XX e mos 92,XXYY/46,XY e dois casos apresentaram heteromorfismos 46,XY,inv(9qh) (espinha bífida) e 46,XX,21ps+ (encefalocele). Concluindo, há uma maior porcentagem de alteração cromossômica restrita ao tecido cérebro-vascular. Essa porcentagem foi semelhante à porcentagem encontrada em tecidos nervosos de roedores. Estes resultados sugerem que anomalias numéricas podem ser muito comuns em tecidos envolvidos no defeito do tubo neural. Entretanto, estes resultados sugerem que estudos futuros com tecido neural em humanos sejam fundamentais para esclarecer a relação entre anomalia cromossômica e tecido nervoso / Abstract: The association between chromosomal abnormalities, specially aneuploidies and neural tube defects (NTDs) is well known, principally when NTD is not the only malformation present. Recently, research in animal models, using fluorescence in situ hybridization (FISH) identified aneuploidy in neural tissues. The aims of this work were to identify the frequency of chromosomal abnormalities in NTDs fetuses and newborns and the possible association of them restricted to cérebro-vascular (CV) tissue. For the detection of aneuploidy conventional cytogenetic studies on lymphocytes and CV tissue and interphase FISH of CV tissue utilizing alfa-centromeric probes of 18 chromosomes (FISH-Multiprobe/Cytocell) were performed. In order to establish the confidence interval of the diploid signals the interphase FISH analysis was performed in 10 control individuals, showing mean near to 100%. Forty one NTDs cases were evaluated and separated into three groups, according to the collected samples and their analysis. Group 1: karyotype from lymphocytes and CV tissue and FISH analysis from both, 13 cases. Group 2: karyotype from CV tissue, 5 cases. Group 3: karyotype from lymphocytes, 23 cases. In group 1, 4 (31,0%) presented abnormal karyotypes restricted to CV tissue: mos 92,XXYY/46,XY, mos92,XXXX/46,XY on spina bifida and monossomy of the chromosome 6 in mosaic on anencephaly. The frequency of chromosomic anomalies in that study was of 6%. A larger percentage of restricted aneuploidies on CV tissue was observed. The aneuploidies percentage found in this tissue was of 15% when studied by conventional cytogenetics and of 25% when analyzed by FISH. In group 2, all samples presented normal karyotypes. In group 3, two cases of anencephaly presented abnormal karyotype: chi47,XY,+21/46,XX and mos92,XXYY/46,XY and two cases presented heteromorphisms 46,XY,inv9(qh) (spina bifida ) and 46,XX,21ps+ (encephalocele). There is a greater proportion of aneuploidy restricted to CV tissue. The percentage observed in that tissue was 25%, similar to neural tissues of rodents in experimental studies (33%). These results suggest that numeric anomalies can be very common in tissue involved with NTD. However, these results suggest that further studies with neural tissue in humans are fundamental to explain the relationship between chromosomic anomaly and nervous tissue / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

O imprinting genômico, processo regulado epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua origem parental, está envolvido no crescimento e desenvolvimento placentário. Na região 11p15.5 encontram-se vários genes regulados por duas regiões controladoras de imprinting (ICR1 e ICR2), onde se encontram as regiões diferencialmente metiladas H19DMR e KvDMR1. Acredita-se que o padrão de imprinting seja dinamicamente regulado durante o desenvolvimento da placenta. Em humanos, há poucas informações sobre imprinting genômico e desenvolvimento placentário, principalmente para estágios precoces do desenvolvimento devido às dificuldades técnicas de obtenção dessas placentas. A descrição de mosaicismo do padrão de metilação restrito a placenta ou entre a placenta e o feto evidencia um perfil epigenético único deste órgão. A 5-hidroximetilação, a qual não tem um papel de silenciamento gênico, pode ser confundida com a metilação do DNA nas análises moleculares. O objetivo principal do presente estudo foi o de verificar a influência da idade gestacional (IG) no perfil de metilação do DNA das ICRs 1 e 2 em vilosidade coriônica, bem como a existência de mosaicismo do perfil de metilação intra-placentário. Neste trabalho também foi investigada a presença de hidroximetilação na KvDMR1. Foram coletadas amostras de tecido placentário, sendo 25 de vilosidades coriônicas (VC) (15 de 3° trimestre gestacional e 10 do 1° trimestre) e nove de cordão umbilical (UC) de 1° trimestre (pareadas com a VC). Quatro placentas de 3° trimestre foram analisadas em separado para o estudo de mosaicismo. O perfil de metilação do DNA das regiões foi verificado por PCR Específica para a Metilação (MS-PCR), Análise Combinada de Bissulfito e Restrição Enzimática (COBRA) e Método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real (DESM-RT), além do ensaio para hidroximetilação na KvDMR1. Com os ensaios qualitativos (MS-PCR e COBRA) foi observado um perfil de metilação monoalélico, sendo que na H19DMR foi identificada a presença de CpGs diferentemente metilados. Para a H19DMR foram observadas médias de 0,43 de metilação em VC e 0,31 em UC de 1° trimestre, e de 0,41 em VC de 3° trimestre. Para a KvDMR1, foram encontradas médias de 0,47 em VC e 0,57 em UC de 1° trimestre, e de 0,41 em VC de 3° trimestre. A presença de hidroximetilação na KvDMR1 foi excluída. Não foram observadas diferenças significativas entre as médias das diferentes IGs ou entre tecidos pelos testes t e F para ambas as regiões. Não foi observada correlação positiva no perfil de metilação para H19DMR e KvDMR1 entre os tecidos. Em relação ao mosaicismo, não houve diferenças significativas no perfil de metilação entre os diferentes cotilédones amostrados numa mesma placenta. Os resultados demonstram uma discordância entre tecido embrionário (UC) e extraembrionário (VC). Apesar de não serem observadas alterações significantes nos perfis de metilação da H19DMR e KvDMR1 em diferentes IGs, as informações apresentadas são importantes para as pesquisas sobre a dinâmica do fenômeno de imprinting genômico ao longo da gestação, para os estudos de mosaicismo intraplacentário bem como o perfil epigenético da placenta em relação a outros tecidos. / Genomic imprinting, an epigenetically regulated process by which genes are expressed accordingly to their parental origin, is involved in placental growth and development. In 11p15.5 region, there are many genes regulated by two Imprinting Control Regions (ICR1 and ICR2), in which are found two Differentially Methylated Regions, H19DMR and KvDMR1, respectively. Imprinting patterns seem to be adjusted during placenta development. In humans, there is little information on genomic imprinting and placental development, especially for early stages of development due to technical difficulties in obtaining these placentas. The description of mosaicism in methylation pattern restricted to placenta or between placenta and fetus shows a unique epigenetic profile of this organ. The 5-hidroxymethylation, which has no role in gene silencing, can be confused with DNA methylation in molecular analysis. The main aim of our study was to verify the influence of gestational age (GA) in DNA methylation profile of ICRs 1 and 2 in chorionic villi, as well as the existence of intra-placental methylation profile mosaicism. The presence of hydroximethylation in the KvDMR1 was also investigated. Samples were collected from placentas, 25 from chorionic villi (CV) (15 of the 3rd gestational trimester and 10 of the 1st trimester) and nine from umbilical cord (UC) in 1st trimester (paired with the CV samples). Four 3rd trimester placentas were separately analyzed for mosaicism. DNA methylation profile was verified by Methylation Specific PCR (MS-PCR), and Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) and Methylation-Sensitive Enzyme Digestion Method associated with Real-Time PCR (DESM-RT), in addition to hydroximethylation test in the KvDMR1 region. With qualitative assays (MS-PCR and COBRA), it was observed a monoallelic methylation pattern, and, only for the H19DMR, differently methylated CpGs were observed. For the H19DMR, we observed methylation means of 0.43 in CV and 0.31 in UC of 1st trimester, and 0.41 in CV of 3rd trimester. For KvDMR1, we observed means of 0.47 in CV and 0.57 in UC of 1st trimester, and 0.41 in CV of 3rd trimester. No hydroximethylation in the KvDMR1 was observed. There were no significant differences between the means of different GAs or between tissues by F and t tests for both regions. No positive correlation was found on methylation profile for H19DMR and KvDMR1 between tissues. In relation to mosaicism, there were no significant differences in methylation profile between different cotyledons sampled in the same placenta. The results showed a discrepancy between embryonic (UC) and extra-embryonic (CV) tissues. Although it was not observed significant changes in methylation profiles of H19DMR and KvDMR1 in different GAs, the presented results are important to research on dynamics of genomic imprinting phenomenon during pregnancy, studies of intra-placental mosaicism and placenta epigenetic profile in relation to other tissues.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:49:52Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-12-31 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Orientador: Carlos Eduardo Steiner / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-17T00:08:21Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cunha_KarinaSoares_M.pdf: 3290868 bytes, checksum: 62ac845d38c989b1515d635bf2bfa79b (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: O Mosaico pigmentar tipo Ito é uma alteração cutânea frequente, caracterizada por hipopigmentação da pele que, na maioria dos casos, segue o padrão linhas de Blaschko, geralmente associada a anomalias extracutâneas, sobretudo anomalias do Sistema Nervoso Central (SNC). Sugere-se que esse padrão decorre da presença e migração de duas linhagens celulares no período embrionário, com diferente expressão de genes associados à pigmentação, que darão origem à epiderme e ao SNC no feto. Diversos tipos de mosaicismo foram associados ao quadro e acredita-se que os casos em que não houve tal detecção se devam à limitação das células analisadas. Devido à função, origem embrionária e migração celular, possivelmente o mosaicismo seria melhor identificado em melanócitos e queratinócitos, principalmente na presença de alterações no SNC, as alterações poderiam ter envolvimento com o prognóstico neurológico. Neste estudo foi realizada análise citogenética de linfócitos e fibroblastos de 15 indivíduos com mosaico pigmentar do tipo Ito. Os objetivos incluíram padronizar a cultura de células de melanócitos e queratinócitos, visando analisar o cariótipo desses indivíduos nesses tipos celulares. O estudo citogenético nesses tipos celulares, porém, não pode ser realizado devido à dificuldade de se obter metáfases adequadas para análise. Assim, foi desenvolvido protocolo de cultura e análise citogenética em queratinócitos, o qual funcionou adequadamente em indivíduos testes, porém sem resultado semelhante nos sujeitos de pesquisa. A preparação cromossômica a partir de melanócitos, por outro lado, não se mostrou adequada. Na análise de linfócitos e fibroblastos, foram encontradas alterações cromossômicas diferentes em quatro indivíduos (26% da casuística), presentes em ambos os tipos celulares. Não foram observadas divergências nas amostras a partir de pele hipo e normopigmentadas. Essas alterações incluíram um caso de t(X;21) regular, para o qual foram realizados estudos complementares de forma a aprimorar a investigação laboratorial, sendo análise por array-CGH, FISH e estudo de inativação de X. Um caso se tratou de trissomia 18 em mosaico, nesse indivíduo não foi possível a coleta de biópsia, porém foi realizado FISH interfásico em células da mucosa oral. Houve também um caso de r(22) em mosaico, o único que apresentou diferença na proporção de células alteradas em fibroblastos e linfócitos, possivelmente por maior instabilidade in vitro de cromossomos em anel em culturas de longa duração. O último caso alterado se refere a um cromossomo marcador, também em mosaico. Os resultados obtidos foram comparados com dados da literatura prévia. Assim, apenas um caso apresentou alteração cromossômica não em mosaico, representada por uma translocação X/autossomo regular, para a qual as técnicas de estudo utilizadas não detectaram justificativa para o padrão de mosaicismo observado clinicamente / Abstract: Pigmentary mosaicism of Ito type is a skin abnormality often characterized by hypopigmentation of the skin following, in most cases, the Blaschko lines, usually associated with extracutaneous abnormalities, especially abnormalities of the central nervous system (CNS). It is suggested that this pattern arises from the presence and migration of two cell lineages in the embryonic period, with different expression of genes associated with pigmentation, which will give rise to the epidermis and the CNS in the fetus. Several types of mosaicism have been associated with this disorder. In cases in which no mosaicismo was detected, it is believed that this may be secondary to the limitation of the cells analyzed. Due to the function and embryonic cell migration, in individuals with pigmentary mosaicism, a cytogenetic mosaicism possibly would be better identified in melanocytes and keratinocytes, especially in the presence of changes in the CNS. Besides, these changes could prognose the neurological outcome. This study comprehended cytogenetic analysis of lymphocytes and fibroblasts from 15 individuals with pigmentary mosaicism of Ito type. The targets included standardize the cell culture of melanocytes and keratinocytes in order to analyze the karyotype of these individuals in these cell types. The cytogenetic study in these cell types, however, was not possible due to difficulties in obtaining adequate metaphases for analysis. Given this difficulty, another cell type (fibroblasts) was studied. In the end, chromosomal abnormalities in lymphocytes and fibroblasts were identified in four individuals. These included one case of a balanced traslocation X/21, one case of trisomy 18 mosaicism, one case of a ring 22 mosaic and one marker chromosome, also in mosaic. Considering the results of cytogenetic lymphocytes and fibroblasts, additional studies were undertaken to enhance the laboratory investigation of these cases, including array-CGH, FISH and study of X inactivation. The results were compared with previous literature data. In conclusion, we developed protocol for culture and cytogenetic analysis in keratinocytes, which worked well on test subjects, but without similar results in study subjects. The chromosome preparation from melanocytes, however, was not adequate. There were no differences in samples from different area of skin. Only one case showed different proportion of cells altered in fibroblasts and lymphocytes, possibly due to instability of ring chromosomes in long duration cultures. Finally, only one case showed no chromosomal abnormality in mosaic, represented by a regular translocation X/autosome, for which the techniques used to study detected no explanation for the pattern of mosaicism observed clinically / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestre em Ciências Médicas

O imprinting genômico, processo regulado epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua origem parental, está envolvido no crescimento e desenvolvimento placentário. Na região 11p15.5 encontram-se vários genes regulados por duas regiões controladoras de imprinting (ICR1 e ICR2), onde se encontram as regiões diferencialmente metiladas H19DMR e KvDMR1. Acredita-se que o padrão de imprinting seja dinamicamente regulado durante o desenvolvimento da placenta. Em humanos, há poucas informações sobre imprinting genômico e desenvolvimento placentário, principalmente para estágios precoces do desenvolvimento devido às dificuldades técnicas de obtenção dessas placentas. A descrição de mosaicismo do padrão de metilação restrito a placenta ou entre a placenta e o feto evidencia um perfil epigenético único deste órgão. A 5-hidroximetilação, a qual não tem um papel de silenciamento gênico, pode ser confundida com a metilação do DNA nas análises moleculares. O objetivo principal do presente estudo foi o de verificar a influência da idade gestacional (IG) no perfil de metilação do DNA das ICRs 1 e 2 em vilosidade coriônica, bem como a existência de mosaicismo do perfil de metilação intra-placentário. Neste trabalho também foi investigada a presença de hidroximetilação na KvDMR1. Foram coletadas amostras de tecido placentário, sendo 25 de vilosidades coriônicas (VC) (15 de 3° trimestre gestacional e 10 do 1° trimestre) e nove de cordão umbilical (UC) de 1° trimestre (pareadas com a VC). Quatro placentas de 3° trimestre foram analisadas em separado para o estudo de mosaicismo. O perfil de metilação do DNA das regiões foi verificado por PCR Específica para a Metilação (MS-PCR), Análise Combinada de Bissulfito e Restrição Enzimática (COBRA) e Método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real (DESM-RT), além do ensaio para hidroximetilação na KvDMR1. Com os ensaios qualitativos (MS-PCR e COBRA) foi observado um perfil de metilação monoalélico, sendo que na H19DMR foi identificada a presença de CpGs diferentemente metilados. Para a H19DMR foram observadas médias de 0,43 de metilação em VC e 0,31 em UC de 1° trimestre, e de 0,41 em VC de 3° trimestre. Para a KvDMR1, foram encontradas médias de 0,47 em VC e 0,57 em UC de 1° trimestre, e de 0,41 em VC de 3° trimestre. A presença de hidroximetilação na KvDMR1 foi excluída. Não foram observadas diferenças significativas entre as médias das diferentes IGs ou entre tecidos pelos testes t e F para ambas as regiões. Não foi observada correlação positiva no perfil de metilação para H19DMR e KvDMR1 entre os tecidos. Em relação ao mosaicismo, não houve diferenças significativas no perfil de metilação entre os diferentes cotilédones amostrados numa mesma placenta. Os resultados demonstram uma discordância entre tecido embrionário (UC) e extraembrionário (VC). Apesar de não serem observadas alterações significantes nos perfis de metilação da H19DMR e KvDMR1 em diferentes IGs, as informações apresentadas são importantes para as pesquisas sobre a dinâmica do fenômeno de imprinting genômico ao longo da gestação, para os estudos de mosaicismo intraplacentário bem como o perfil epigenético da placenta em relação a outros tecidos. / Genomic imprinting, an epigenetically regulated process by which genes are expressed accordingly to their parental origin, is involved in placental growth and development. In 11p15.5 region, there are many genes regulated by two Imprinting Control Regions (ICR1 and ICR2), in which are found two Differentially Methylated Regions, H19DMR and KvDMR1, respectively. Imprinting patterns seem to be adjusted during placenta development. In humans, there is little information on genomic imprinting and placental development, especially for early stages of development due to technical difficulties in obtaining these placentas. The description of mosaicism in methylation pattern restricted to placenta or between placenta and fetus shows a unique epigenetic profile of this organ. The 5-hidroxymethylation, which has no role in gene silencing, can be confused with DNA methylation in molecular analysis. The main aim of our study was to verify the influence of gestational age (GA) in DNA methylation profile of ICRs 1 and 2 in chorionic villi, as well as the existence of intra-placental methylation profile mosaicism. The presence of hydroximethylation in the KvDMR1 was also investigated. Samples were collected from placentas, 25 from chorionic villi (CV) (15 of the 3rd gestational trimester and 10 of the 1st trimester) and nine from umbilical cord (UC) in 1st trimester (paired with the CV samples). Four 3rd trimester placentas were separately analyzed for mosaicism. DNA methylation profile was verified by Methylation Specific PCR (MS-PCR), and Combined Bisulfite Restriction Analysis (COBRA) and Methylation-Sensitive Enzyme Digestion Method associated with Real-Time PCR (DESM-RT), in addition to hydroximethylation test in the KvDMR1 region. With qualitative assays (MS-PCR and COBRA), it was observed a monoallelic methylation pattern, and, only for the H19DMR, differently methylated CpGs were observed. For the H19DMR, we observed methylation means of 0.43 in CV and 0.31 in UC of 1st trimester, and 0.41 in CV of 3rd trimester. For KvDMR1, we observed means of 0.47 in CV and 0.57 in UC of 1st trimester, and 0.41 in CV of 3rd trimester. No hydroximethylation in the KvDMR1 was observed. There were no significant differences between the means of different GAs or between tissues by F and t tests for both regions. No positive correlation was found on methylation profile for H19DMR and KvDMR1 between tissues. In relation to mosaicism, there were no significant differences in methylation profile between different cotyledons sampled in the same placenta. The results showed a discrepancy between embryonic (UC) and extra-embryonic (CV) tissues. Although it was not observed significant changes in methylation profiles of H19DMR and KvDMR1 in different GAs, the presented results are important to research on dynamics of genomic imprinting phenomenon during pregnancy, studies of intra-placental mosaicism and placenta epigenetic profile in relation to other tissues.

Orientadores: Andréa Trevas Maciel Guerra, Maricilda Palandi de Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T00:38:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Santos_AnaPaulados_M.pdf: 2717833 bytes, checksum: 8a3a2ff5cccd42ca60c0bc51ba3b0067 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: As disgenesias gonadais parcial (DGP) e mista (DGM) caracterizam-se por ambiguidade genital e presença de gônada disgenética associada a testículo disgenético ou dois testículos disgenéticos. Na DGP o cariótipo é 46,XY; na DGM, há mosaico 45,X/46,XY ou suas variantes (mais de duas linhagens e (ou) anomalias estruturais do cromossomo Y). Esses mosaicos podem determinar, ainda, fenótipo feminino com síndrome de Turner (ST), distúrbio da diferenciação do sexo ovotesticular (DDS OT) e esterilidade em homens com genitais normais. Independentemente do fenótipo gonadal e genital, esses indivíduos apresentam outros sinais clínicos decorrentes da linhagem 45,X, como baixa estatura, dismorfismos, anomalias cardíacas e renais e diversas afecções adquiridas. Nos últimos anos surgiram evidências de ligação entre microdeleções do Y e o mosaicismo com linhagem 45,X. Há, ainda, indicações de que a instabilidade cromossômica trazida por essas deleções possa ser mais pronunciada nas gônadas. O objetivo deste trabalho foi investigar a presença de microdeleções do Y em indivíduos com DGP e naqueles com mosaico 45,X/46,XY ou suas variantes e diferentes fenótipos. A casuística constou de 15 indivíduos com DGP e 15 com mosaicismo, dos quais a maioria apresentava DGM (11 casos). Foram analisados 38 sequence tagged sites (STS) cobrindo a região específica masculina (MSY, male specific region) em Yp, centrômero e Yq por meio da técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR) multiplex e individual. Todos os STS investigados nos indivíduos com DGP tiveram amplificação positiva, porém havia STS de Yq ausentes em seis indivíduos com mosaicismo e DGM, dos quais dois sem alterações estruturais de Y evidentes ao cariótipo. Essas deleções se localizavam em regiões contendo genes relacionados à espermatogênese (AZFb e AZFc - azoospermia factor). A ausência de deleções nos indivíduos com DGP não confirma a hipótese de que a instabilidade desse cromossomo nas gônadas seja uma das causas dessa afecção. Por outro lado, as deleções encontradas no segundo grupo indicam, em alguns casos, associação entre alterações estruturais do Y detectáveis somente a nível molecular e o surgimento de mosaicismo. Caso sejam criados no sexo masculino e busquem procedimentos de fertilização in vitro, há risco de que esses indivíduos transmitam cromossomos Y instáveis na divisão celular / Abstract: Partial and mixed gonadal dysgenesis (PGD and MGD) are characterized by genital ambiguity and the finding of either a streak gonad and a dysgenetic testis or two dysgenetic testes. In PGD there is a 46,XY karyotype, whereas in MGD there is a 45,X/46,XY mosaic or its variants (more than two lineages and/or structural abnormalities of the Y chromosome). These mosaics are also compatible with a female phenotype and Turner syndrome, ovotesticular disorder of sex development, and infertility in men with normal external genitalia. Regardless of the gonadal and genital phenotypes, these individuals present other clinical features associated with the 45,X cell line, including short stature, dysmorphisms, cardiovascular and renal anomalies and various acquired diseases. During the last few years, evidences of a link between Y microdeletions and 45,X mosaicism have been reported. There are also indications that the instability caused by such deletions might be more significant in germ cells. The aim of this work was to investigate the presence of Y chromosome microdeletions in individuals with PGD and in those with 45,X/46,XY mosaicism or its variants and variable phenotypes. Our sample comprised 15 individuals with PGD and 15 with mosaicism, most of them with a MGD phenotype (n=11). Thirty-eight sequence tagged sites (STS) spanning the male specific region (MSY) on the Y chromosome (Yp, centromere and Yq) where analyzed by multiplex PCR and some individual reactions. All STS showed positive amplifications in the PGD group. Conversely, in the group with mosaicism, six individuals with MGD had been identified with Yq microdeletions, two of them did not have structural abnormalities of the Y chromosome recognized by routine cytogenetic analysis. The deleted STSs were located within AZFb and AZFc (Azoospermia Factor) regions, which harbor several genes responsible for spermatogenesis. Absence of deletions in individuals with PGD does not confirm the hypothesis that instability of the Y chromosome in the gonads could be one of the causes of such condition. However, deletions identified in the second group indicate that mosaicism may be associated with Y chromosome abnormalities detectable only at the molecular level. If patients with mosaicism and Y microdeletions reared as males decide to undergo in vitro fertilization, Y chromosomes which tend to be unstable during cell division may be transmitted to offspring / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

O imprinting genômico, processo regulado epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua origem parental (paterna ou materna), está envolvido no desenvolvimento placentário. Na região cromossômica 11p15.5 encontram-se vários genes importantes para o desenvolvimento fetal e da placenta, os quais são regulados por duas principais regiões controladoras de imprinting (ICR1 e 2) onde se encontram as regiões diferencialmente metiladas H19DMR e KvDMR1, respectivamente. O imprinting genômico e a inativação aleatória do cromossomo X são processos epigenéticos presentes em mamíferos placentários. O presente trabalho teve como objetivo principal verificar a presença de mosaicismo do perfil epigenético entre tecidos extraembrionários de estágios precoces da gravidez (primeiro trimestre), e em vilosidade coriônica de placentas a termo (terceiro trimestre). Foram coletadas amostras de 10 gestações de primeiro trimestre (vilosidade coriônica, âmion, membrana de cordão umbilical e tecido embrionário) e 14 de terceiro trimestre (vilosidade coriônica), das quais 10 foram consideradas como controles e quatro utilizadas para estudo de mosaicismo restrito à vilosidade coriônica (coleta de amostras de todos os cotilédones). Após extração do DNA, foi utilizado o Método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real para o estudo do padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em diferentes tecidos do primeiro trimestre gestacional e em tecido placentário do terceiro trimestre. O padrão de inativação do cromossomo X foi avaliado em todos os cotilédones de duas placentas a termo, de fetos do sexo feminino, por meio do ensaio do receptor de andrógeno humano (HUMARA assay), utilizando eletroforese capilar, e com acréscimo de um novo marcador de inativação do cromossomo X (ICX1). Na análise estatística foram utilizados o teste t não pareado, teste de Turkey e teste t pareado. A média de metilação da KvDMR1 das amostras de vilosidade coriônica do primeiro trimestre gestacional foi estatisticamente diferente da média de metilação do terceiro trimestre. Enquanto que a metilação da H19DMR não apresentou diferença estatística entre amostras de vilosidade coriônica do primeiro e do terceiro trimestre gestacionais. Com relação ao mosaicismo, a KvDMR1 não apresentou variação com relação ao tamanho ou a posição dos cotilédones, enquanto que a H19DMR apresentou diferença estatisticamente significativa na média de metilação com relação ao tamanho dos cotilédones e ao posicionamento nos quadrantes; em consequência da hipometilação em cotilédones pertencentes a uma das placentas estudadas. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na média de metilação da KvDMR1 e da H19DMR entre diferentes tecidos das amostras do primeiro trimestre gestacional. No entanto, a comparação entre tecidos pareados de um mesmo indivíduo mostrou que a metilação não é correspondente entre os tecidos. Os dados obtidos mostram que o imprinting genômico provavelmente é um processo dinâmico, que evolui ao longo da gestação, estando relacionado a formação e ao amadurecimento da placenta. No presente estudo foi possível verificar que cotilédones de uma mesma placenta apresentam diferentes padrões de inativação do cromossomo X. Diferenças que podem ser explicadas pela expansão clonal das células trofoblásticas progenitoras com o cromossomo X paterno ou o cromossomo X materno inativo. Devido à variabilidade epigenética, exames em tecidos placentários devem considerar as diferenças intra-placentárias e as diferenças entre tecidos embrionários e extraembrionários. / Genomic imprinting, a mechanism of allele-specific expression depending on parental origin, is an epigenetic process that regulates the expression of many genes involved in placental development. Several important genes for fetal and placental growth are located on the human chromosome region 11p15.5, which are regulated by two imprinting control regions (ICR1 e 2), which have the differentially methylated regions H19DMR and KvDMR1, respectively. Genomic imprinting and random inactivation of X chromosome are two epigenetic processes present in placental mammals. The present study aimed to verify the presence of epigenetic mosaicism between extra-embryonic and embryonic tissues from early stages of pregnancy (first trimester), and in chorionic villi of term placentas (third trimester). Samples were collected from 10 pregnancies in the first trimester (chorionic villous, amnion, umbilical cord membrane, and embryonic tissue) and 14 from third trimester (chorionic villus sampling), of which 10 were considered as controls and four used to study mosaicism restricted to chorionic villi (sampling of all cotyledons). After DNA extraction, we used real time PCR associated to enzymatic restriction with a methylation sensitive enzyme to study the methylation pattern of KvDMR1 and H19DMR in different tissues from first trimester and placental third trimester tissue. The pattern of X chromosome inactivation was evaluated in all cotyledons from two term placentas of female fetuses, using the human androgen receptor (HUMARA) assay, capillary electrophoresis, and adding a new X chromosome inactivation (ICX1) marker. Unpaired and paired t and Turkey tests were used in statistical analysis. The average methylation of KvDMR1 of chorionic villi samples in first trimester was statistically different from average methylation of the third trimester. While the methylation of H19DMR showed no statistically significant difference between chorionic villi samples in the first and third trimester of pregnancy. In relation to the mosaicism, the KvDMR1 methylation did not vary in respect to the size or position of the cotyledons, while H19DMR showed statistically significant difference in average methylation relative to the size of the cotyledons, to the position in quadrants, due to the hypomethylation in cotyledons from one studied placenta. There were no statistically significant differences in the mean methylation KvDMR1 and H19DMR among different tissues from the first trimester of pregnancy, however, the comparison between paired tissues from the same individual showed that the methylation is different between tissues. The data from this study showed that genomic imprinting is probably a dynamic process and evolved across human pregnancy. This process is probable connected to placenta formation and maturation. We observed different patterns of X chromosome inactivation in cotyledons from the same placenta. This difference could be explained by clonal expansion of a limited number of trophoblastic progenitor cells with either an inactive maternal or paternal X chromosome. Due to the epigenetic variability, placental tissue examinations must consider the differences intra-placental and differences between embryonic and extra-embryonic tissues.

O imprinting genômico, processo regulado epigeneticamente segundo o qual os genes se expressam de acordo com sua origem parental (paterna ou materna), está envolvido no desenvolvimento placentário. Na região cromossômica 11p15.5 encontram-se vários genes importantes para o desenvolvimento fetal e da placenta, os quais são regulados por duas principais regiões controladoras de imprinting (ICR1 e 2) onde se encontram as regiões diferencialmente metiladas H19DMR e KvDMR1, respectivamente. O imprinting genômico e a inativação aleatória do cromossomo X são processos epigenéticos presentes em mamíferos placentários. O presente trabalho teve como objetivo principal verificar a presença de mosaicismo do perfil epigenético entre tecidos extraembrionários de estágios precoces da gravidez (primeiro trimestre), e em vilosidade coriônica de placentas a termo (terceiro trimestre). Foram coletadas amostras de 10 gestações de primeiro trimestre (vilosidade coriônica, âmion, membrana de cordão umbilical e tecido embrionário) e 14 de terceiro trimestre (vilosidade coriônica), das quais 10 foram consideradas como controles e quatro utilizadas para estudo de mosaicismo restrito à vilosidade coriônica (coleta de amostras de todos os cotilédones). Após extração do DNA, foi utilizado o Método de Digestão Enzimática Sensível à Metilação Associada à PCR em Tempo Real para o estudo do padrão de metilação da KvDMR1 e da H19DMR em diferentes tecidos do primeiro trimestre gestacional e em tecido placentário do terceiro trimestre. O padrão de inativação do cromossomo X foi avaliado em todos os cotilédones de duas placentas a termo, de fetos do sexo feminino, por meio do ensaio do receptor de andrógeno humano (HUMARA assay), utilizando eletroforese capilar, e com acréscimo de um novo marcador de inativação do cromossomo X (ICX1). Na análise estatística foram utilizados o teste t não pareado, teste de Turkey e teste t pareado. A média de metilação da KvDMR1 das amostras de vilosidade coriônica do primeiro trimestre gestacional foi estatisticamente diferente da média de metilação do terceiro trimestre. Enquanto que a metilação da H19DMR não apresentou diferença estatística entre amostras de vilosidade coriônica do primeiro e do terceiro trimestre gestacionais. Com relação ao mosaicismo, a KvDMR1 não apresentou variação com relação ao tamanho ou a posição dos cotilédones, enquanto que a H19DMR apresentou diferença estatisticamente significativa na média de metilação com relação ao tamanho dos cotilédones e ao posicionamento nos quadrantes; em consequência da hipometilação em cotilédones pertencentes a uma das placentas estudadas. Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas na média de metilação da KvDMR1 e da H19DMR entre diferentes tecidos das amostras do primeiro trimestre gestacional. No entanto, a comparação entre tecidos pareados de um mesmo indivíduo mostrou que a metilação não é correspondente entre os tecidos. Os dados obtidos mostram que o imprinting genômico provavelmente é um processo dinâmico, que evolui ao longo da gestação, estando relacionado a formação e ao amadurecimento da placenta. No presente estudo foi possível verificar que cotilédones de uma mesma placenta apresentam diferentes padrões de inativação do cromossomo X. Diferenças que podem ser explicadas pela expansão clonal das células trofoblásticas progenitoras com o cromossomo X paterno ou o cromossomo X materno inativo. Devido à variabilidade epigenética, exames em tecidos placentários devem considerar as diferenças intra-placentárias e as diferenças entre tecidos embrionários e extraembrionários. / Genomic imprinting, a mechanism of allele-specific expression depending on parental origin, is an epigenetic process that regulates the expression of many genes involved in placental development. Several important genes for fetal and placental growth are located on the human chromosome region 11p15.5, which are regulated by two imprinting control regions (ICR1 e 2), which have the differentially methylated regions H19DMR and KvDMR1, respectively. Genomic imprinting and random inactivation of X chromosome are two epigenetic processes present in placental mammals. The present study aimed to verify the presence of epigenetic mosaicism between extra-embryonic and embryonic tissues from early stages of pregnancy (first trimester), and in chorionic villi of term placentas (third trimester). Samples were collected from 10 pregnancies in the first trimester (chorionic villous, amnion, umbilical cord membrane, and embryonic tissue) and 14 from third trimester (chorionic villus sampling), of which 10 were considered as controls and four used to study mosaicism restricted to chorionic villi (sampling of all cotyledons). After DNA extraction, we used real time PCR associated to enzymatic restriction with a methylation sensitive enzyme to study the methylation pattern of KvDMR1 and H19DMR in different tissues from first trimester and placental third trimester tissue. The pattern of X chromosome inactivation was evaluated in all cotyledons from two term placentas of female fetuses, using the human androgen receptor (HUMARA) assay, capillary electrophoresis, and adding a new X chromosome inactivation (ICX1) marker. Unpaired and paired t and Turkey tests were used in statistical analysis. The average methylation of KvDMR1 of chorionic villi samples in first trimester was statistically different from average methylation of the third trimester. While the methylation of H19DMR showed no statistically significant difference between chorionic villi samples in the first and third trimester of pregnancy. In relation to the mosaicism, the KvDMR1 methylation did not vary in respect to the size or position of the cotyledons, while H19DMR showed statistically significant difference in average methylation relative to the size of the cotyledons, to the position in quadrants, due to the hypomethylation in cotyledons from one studied placenta. There were no statistically significant differences in the mean methylation KvDMR1 and H19DMR among different tissues from the first trimester of pregnancy, however, the comparison between paired tissues from the same individual showed that the methylation is different between tissues. The data from this study showed that genomic imprinting is probably a dynamic process and evolved across human pregnancy. This process is probable connected to placenta formation and maturation. We observed different patterns of X chromosome inactivation in cotyledons from the same placenta. This difference could be explained by clonal expansion of a limited number of trophoblastic progenitor cells with either an inactive maternal or paternal X chromosome. Due to the epigenetic variability, placental tissue examinations must consider the differences intra-placental and differences between embryonic and extra-embryonic tissues.

Orientadores: Andréa Trevas Maciel-Guerra, Vera Lúcia Gil da Silva Lopes / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T23:41:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Latuf_JulianadePaulo_M.pdf: 2398402 bytes, checksum: cbd1c5c98ab12541607b0be2b5ca8120 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: Quadros de ambiguidade genital e esterilidade com cariótipo 46,XY podem ser devidos a mosaico com linhagem 45,X não detectável no cariótipo em linfócitos de sangue periférico. Quando essa linhagem não é detectada, esses indivíduos deixam de ser investigados em relação a uma série de problemas clínicos. Este trabalho teve como objetivo verificar se a hibridação in situ com fluorescência (FISH) em células de mucosa oral poderia ser empregada para detectar criptomosaicismo com linhagem 45,X em indivíduos com cariótipo 46,XY. A casuística foi composta por 19 homens saudáveis com idades entre 20 e 30 anos e cinco pacientes com distúrbios da diferenciação do sexo (DDS) com idades entre 5 e 23 anos, quatro com mosaico 45,X/46,XY e um com disgenesia testicular 46,XY associada a déficit de crescimento. Após confirmar que os jovens saudáveis tinham cariótipo 46,XY em 50 metáfases de linfócitos de sangue periférico, foi realizada análise por FISH com sondas específicas para os cromossomos X e Y em 1.000 núcleos interfásicos de linfócitos de sangue periférico e 1.000 de mucosa oral, seguida de comparação da proporção de núcleos contendo apenas o sinal do cromossomo X nos dois tecidos. A mesma análise foi feita nos cinco pacientes com DDS. A distribuição da proporção dos núcleos interfásicos de linfócitos e mucosa oral contendo apenas o sinal do X nos jovens saudáveis foi compatível com a distribuição normal, e número superior a 12:1.000 em linfócitos e 13:1.000 em mucosa oral devem ser considerados indicativos de mosaicismo em nosso laboratório. A frequência desses núcleos nos dois tecidos não diferiu significativamente (p=0,6855). Nos cinco pacientes com DDS a frequência de núcleos contendo apenas o sinal do X diferiu significativamente da observada em indivíduos normais em linfócitos (p=0,0008) e mucosa oral (p=0,0008). No paciente com cariótipo prévio 46,XY a linhagem 45,X foi confirmada por FISH em metáfases, e em um dos casos de mosaicismo foram detectadas linhagens celulares adicionais. Também não houve diferença significativa entre a frequência de núcleos contendo apenas o sinal do X nos dois tecidos desses pacientes (p=0,3750). Estes resultados indicam que a pesquisa de mosaicismo com linhagem 45,X em indivíduos com DDS ou esterilidade e cariótipo 46,XY pode ser feita por meio de FISH em mucosa oral, com vantagens evidentes em termos de custo e rapidez, além de ser feita a partir de tecido obtido de modo não invasivo / Abstract: Ambiguous genitalia and sterility with a 46,XY karyotype may be due to mosaicism with a 45, X karyotype not detectable in peripheral blood lymphocytes. When this cell line is not detected, these individuals fail to be investigated over a range of clinical problems. This study aimed to verify whether fluorescence in situ hybridization (FISH) in cells from buccal smear could be employed to detect cryptomosaicism with a 45,X cell line in individuals with a 46,XY karyotype. The sample consisted of 19 healthy men aged 20 to 30 years and five patients with disorders of sex development (DSD) aged 5 to 23 years, four with mosaicism 45,X/46,XY and one with testicular dysgenesis 46, XY associated with growth deficiency. After confirming that the healthy young men had a 46,XY karyotype in 50 metaphases from peripheral blood lymphocytes, FISH analysis with probes specific for chromosomes X and Y was done in 1,000 nuclei from peripheral blood lymphocytes and 1,000 from buccal smear, followed by comparison of the proportion of nuclei containing only the signal of the X chromosome in these tissues. The same analysis was performed in five patients with DDS. The distribution of the proportion of interphase nuclei of lymphocytes and buccal smear containing only the X signal in healthy young was consistent with normal distribution; a number greater than 12:1,000 in lymphocytes and 13:1,000 in buccal smear should be considered indicative of mosaicism in our laboratory. The frequency of these nuclei in both tissues did not differ significantly (p = 0.6855). In patients with DDS the frequency of nuclei containing only the X signal differed significantly from that observed in normal individuals both in lymphocytes (p = 0.0008) and buccal smear (p = 0.0008). In the patient with a prior 46,XY karyotype, a 45,X cell line was confirmed by FISH in metaphases, and in one case of mosaicism additional cell lines were detected. There was also no significant difference between the frequency of nuclei containing only the X signal in the two tissues of these patients (p = 0.3750). These results indicate that investigation of mosaicism with 45,X cell line in individuals with 46,XY DSD or sterility can be done by FISH in cells from buccal smear, with obvious advantages in terms of cost and speed, using a tissue obtained noninvasively / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas