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Previous issue date: 2011-06-17 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Chitinases are enzymes involved in degradation of chitin and are present in a range of organisms, including those that do not contain chitin, such as bacteria, viruses, plants and animals, and play important physiological and ecological roles. Chitin is
hydrolyzed by a chitinolytic system classified as: endo-chitinases, exo-chitinases and N-acetyl-b-D-glucosaminidases. In this study a Litochitinase1 extracted from the cephalotorax of the shrimp Litopenaeus Schmitt was purified 987.32 times using ionexchange chromatography DEAE-Biogel and molecular exclusion Sephacryl S-200.
These enzyme presented a molecular mass of about 28.5 kDa. The results, after kinetic assay with the Litochitinase1 using as substrate p-nitrophenyl-N-acetyl-b-Dglucosaminideo, showed apparent Km of 0.51 mM, optimal activity at pH ranging from
5.0 to 6.0, optimum temperature at 55?C and stability when pre-incubated at temperatures of 25, 37, 45, 50 and 55?C. The enzyme showed a range of stability at pH 4.0 to 5.5. HgCl2 inhibited Litochitinase1 while MgCl2 enhances its activity.
Antimicrobial tests showed that Litochitinase1 present activity against gram-negative bacterium Escherichia coli in the 800 μg/mL concentration. The larvicidal activity against Aedes aegypti was investigated using crude extracts, F-III (50-80%) and Litochitinase1 at 24 and 48 hours. The results showed larvicidal activity in all these samples with EC50 values of 6.59 mg/mL for crude extract, 5.36 mg/mL for F-III and 0.71 mg/mL for Litochitinase1 at 24 hours and 3.22 and 0.49 mg/mL for the F-III and Litochitinase1 at 48 hours, respectively. Other experiments confirmed the presence of chitin in the midgut of Aedes aegypti larvae, which may be suffering the action of
Litochitinase1 killing the larvae, but also the absence of contaminating proteins as serine proteinase inhibitors and lectins in the crude extract, F-III and Litochitinase1, indicating that the death of the larvae is by action of the Litochitinase1. We also
observed that the enzymes extracted from intestinal homogenate of the larvae no have activity on Litochitinase1. These results indicate that the enzyme can be used as an alternative to control of infections caused by Escherichia coli and reducing the infestation of the mosquito vector of dengue. / As quitinases s?o enzimas envolvidas na degrada??o da quitina e est?o presentes em uma gama de organismos, inclusive os que n?o cont?m quitina, tais como bact?rias, v?rus, plantas e animais desempenhando importantes papeis fisiol?gicos e ecol?gicos. A quitina ? hidrolisada por um sistema quitinol?tico classificado como: Endo-quitinases, Exo-quitinases e N-acetil-b-D-glucosaminidases. Neste trabalho, a Litochitinase1 foi extra?da do cefalot?rax do camar?o marinho Litopenaeus schmitti e purificada 987,32 vezes utilizando-se cromatografia de troca i?nica DEAE-Biogel e de exclus?o molecular Sephacryl S-200. Esta apresentou massa molecular em torno de 28,5 kDa. Os resultados obtidos, ap?s os testes cin?ticos com a Litochitinase1
utilizando-se como substrato o p-nitrofenil-N-acetil-b-D-glucosaminideo, mostraram Km aparente de 0,51 mM, atividade ?tima em pH variando de 5,0 a 6,0, temperatura
?tima a 55?C e estabilidade de atividade quando pr?-incubada nas temperaturas de 25, 37, 45, 50 e 55?C. A enzima apresentou uma faixa de estabilidade nos pHs de 4,0 a 5,5. O HgCl2, inibiu significativamente a Litochitinase1 enquanto que o MgCl2
potencializa levemente sua atividade. Os testes antimicrobianos realizados mostraram que a Litochitinase1 apresenta atividade contra a bact?ria gram-negativa Escherichia coli numa concentra??o que varia 800 a 500 μg/mL. A atividade larvicida
contra Aedes aegypti foi investigada com os extratos brutos, F-III (50-80%) e na Litochitinase1 com tempo de 24 e 48 horas. Os resultados obtidos mostraram atividade larvicida em todas estas amostras com valores de EC50 de 6,59 mg/mL
para o extrato bruto, 5,36 mg/mL para F-III e 0,71 mg/mL para Litochitinase1 com 24 horas de ensaio e 3,22 e 0,49 mg/mL, para F-III e Litochitinase1 no tempo de 48 horas. Outros experimentos realizados confirmaram a presen?a de quitina no intestino m?dio das larvas de Aedes aegypti, as quais podem estar sofrendo a a??o da Litochitinase1 provocando suas mortes, como ainda a aus?ncia de prote?nas bioativas como inibidores de proteases ser?nicas e lectinas no extrato bruto, F-III e Litochitinase1, indicando que a morte das larvas ? mesmo por a??o da
Litochitinase1. Observou-se ainda que, as enzimas extra?das do homogenato intestinal das larvas n?o interferiram na atividade da Litochitinase1. Estes resultados indicam que esta enzima pode ser usada como alternativa para controlar infec??es causadas por Escherichia coli, como tamb?m na redu??o da infesta??o do mosquito vetor da dengue.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:repositorio.ufrn.br:123456789/12585 |
| Date | 17 June 2011 |
| Creators | Godone, Roberta Luciana do Nascimento |
| Contributors | CPF:58024867320, http://lattes.cnpq.br/6644671747055211, Lima, Jo?o Paulo Matos Santos, CPF:79332021368, http://lattes.cnpq.br/3289758851760692, Lima Filho, Jos? Luiz de, CPF:21638241449, http://lattes.cnpq.br/2834403735297272, Uchoa, Adriana Ferreira |
| Publisher | Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Programa de P?s-Gradua??o em Bioqu?mica, UFRN, BR, Bioqu?mica; Biologia Molecular |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Repositório Institucional da UFRN, instname:Universidade Federal do Rio Grande do Norte, instacron:UFRN |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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