Produtos de glicação avançada (AGE) prejudicam o metabolismo de lipoproteínas e o transporte reverso de colesterol, o que contribui para a aterosclerose no diabete melito (DM). Em particular, a albumina modificada por AGE (albumina-AGE) reduz a remoção de colesterol por diminuir o conteúdo do receptor ABCA-1 em macrófagos. Isto se vincula ao insulto oxidativo e inflamatório, os quais são indutores do estresse do retículo endoplasmático (RE). O objetivo do presente estudo foi avaliar, em macrófagos, os efeitos do tratamento com albumina-AGE sobre o estresse do RE e suas vias adaptativas (UPR), relacionando-os com o prejuízo na expressão do ABCA-1 e efluxo de colesterol celular. Albumina-AGE foi produzida pela incubação de albumina isenta em ácidos graxos com glicolaldeído 10 mM e, albumina controle (albumina-C) com PBS apenas. Albumina foi isolada do soro de pacientes portadores de DM com controle glicêmico inadequado (albumina-DM) ou indivíduos controles (albumina não- DM) por cromatografia para separação rápida de proteínas seguida por purificação alcoólica. Macrófagos de peritônio de camundongos ou macrófagos da linhagem J774 foram tratados com os diferentes tipos de albumina na presença ou ausência de ácido fenil butírico (PBA; chaperona química que alivia o estresse do RE) ou MG-132 (inibidor do sistema proteasomal) por diferentes intervalos de tempo. A expressão de marcadores do estresse do RE, UPR, proteína dissulfeto isomerase (PDI), calreticulina e ubiquitina foi determinada por imunoblot e o conteúdo de ABCA-1, por citometria de fluxo e imunocitoquímica. O efluxo de 14Ccolesterol foi avaliado, utilizando-se apoA-I como aceptora de colesterol. A albumina-AGE induziu aumento tempo-dependente na expressão das chaperonas marcadoras do estresse do RE - Gr78 e Grp94 - e de proteínas da UPR (ATF6 e eIF2-P) em comparação à albumina-C. O conteúdo de ABCA-1 e o efluxo de colesterol foram reduzidos em, respectivamente, 33% e 47% e ambos foram restaurados pelo tratamento com PBA, o qual também reduziu o estresse do RE. A associação entre estresse de RE e redução de ABCA-1 foi confirmada pelo uso da tunicamicina (indutor clássico de estresse do RE), que diminuiu em 61% o conteúdo de ABCA-1, prejudicando em 82% o efluxo de colesterol. A albumina-AGE aumentou o conteúdo total de ubiquitina. A inibição do sistema proteasomal não foi capaz de restaurar o conteúdo de ABCA-1 em células tratadas com albumina-AGE. Em macrófagos expostos à albumina-DM evidenciou-se maior expressão da PDI e calreticulina, com tendência à maior expressão da Grp94. A albumina-AGE (produzida in vitro ou isolada de portadores de DM) induz estresse de RE, o qual se vincula à redução no conteúdo de ABCA-1 e efluxo de colesterol. Estes eventos podem contribuir para a aterosclerose no DM. Chaperonas químicas, que aliviam o estresse do RE, podem ser ferramentas úteis na prevenção e tratamento da aterosclerose / Advanced glycation end products (AGE) disturb lipoprotein metabolism and reverse cholesterol transport, contributing to atherosclerosis in diabetes mellitus (DM). Particularly, advanced glycated albumin (AGE-albumin) reduces cell cholesterol removal by impairing the expression of ABCA-1 in macrophages. This is ascribed to the oxidative and inflammatory stress, conditions that elicit endoplasmic reticulum (ER) stress. In this study it was investigated the effect of AGE-albumin on ER stress and adaptative pathways (UPR) development in macrophages, and its relationship to the reduction in ABCA-1 expression and cholesterol efflux. AGE-albumin was prepared by incubating fatty acid free albumin with 10 mM glycolaldehyde and control albumin (C-albumin) with PBS only. Albumin was isolated from poorly controlled DM patients (DM-albumin) and control individuals (nonDMalbumin) by fast liquid chromatography and purified by alchoolic extraction. Mouse peritoneal macrophages or J774 cells were treated along time with the different types of albumin in the absence or presence of phenyl butiric acic (PBA; a chaperone that aleviates ER stress) or MG132 (a proteasomal inhibitor). The expression of ER stress and UPR markers, protein disulfide isomerase (PDI), calreticulin and ubiquitin was determined by immunoblot and ABCA-1 protein level, by flow cytometry and imunocytochemistry. 14Ccholesterol efflux was evaluated utilizing apo A-I as cholesterol acceptor. AGE-albumin induced a time-dependent increase in the expression of ER stress chaperone markers - Gr78 and Grp94 - and UPR proteins (ATF6 and eIF2-P) in comparison to C-albumin. ABCA-1 content and cholesterol efflux were diminished by, respectively, 33% and 47% and both were recovered by the treatment with PBA. The association between ER stress and ABCA-1 reduction was confirmed by the reduction, induced by tunicanycin (a classical ER stress inductior) in ABCA-1 protein level (61%) and cholesterol efflux (82%). AGE-albumin increased the amount of cellular total ubiquitin. The inhibiton of proteasomal system was unable to restore ABCA-1 protein level in cells treated with AGE-albumin. In macrophages exposed to DM-albumin a higher expression of PDI and calreticulin was observed together with a trend of enhanced Grp94 expression. In conclusion, AGE-albumin (produced in vitro or isolated from DM patients) induces ER stress which is related to the reduction in ABCA-1 level and cholesterol efflux in macrophages. These events can contribute to atherosclerosis in DM. Chemical chaperones that alleviate ER stress may be useful in the prevention and treatment of atherosclerosis
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-02102012-100748 |
| Date | 14 August 2012 |
| Creators | Castilho, Gabriela |
| Contributors | Passarelli, Marisa |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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