A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores e situações onde é comum que proteínas sofram ação de agentes oxidantes. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Para investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. Uma vez que estes resultados não concordam com as vias de sinalização ativadas classicamente por HSP70, via receptor TLR4, observamos uma nova interação com o receptor dos produtos finais de glicação avançada em um modelo de cultura de células A549 através de sondas fluorescentes. A quantificação do experimento mostrou um maior número de interações quando as células são tratadas com HSP70 na sua conformação ligada à ATP em comparação com o tratamento com HSP70 na sua conformação ligada à ADP; e, através de sucessivos experimentos de docking molecular propusemos um modelo putativo para a interação. Além disso, mostramos que na conformação ligada à ADP, a HSP70 interage preferencialmente com TLR4, de forma similar ao peptídeo MD-2, necessário para o reconhecimento de LPS, sugerindo que a chaperona atue como uma molécula acessória ou como citocina, dependendo do receptor e da situação patológica ou fisiológica. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli and conditions where is common to proteins to suffer the action of oxidative agents. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70. We observed that the Oxidation of HSP70 altered its protein structure; and that macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability. As these results do not concur with the signaling pathways classically activated by HSP70, via TLR4, we observed a new interaction with the receptor for advanced glycation end products through fluorescent probes in a A549 cell culture model. Quantification of the experiment showed a higher number of interactions when cells are treated with HSP70 bound to ATP when compared to the treatment with HSP70 in the conformation ADP-bound; and, by successive molecular docking experiments, we proposed a putative model for such interaction. Moreover, we showed that on its ADP-bound conformation, HSP70 binds preferentially to TLR4, in a similar way as the peptide MD-2, necessary for the recognizing of LPS, suggesting that the chaperone could act as an accessory molecule or as a cytokine, depending on the receptor and physiological or pathological situation.

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores e situações onde é comum que proteínas sofram ação de agentes oxidantes. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Para investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. Uma vez que estes resultados não concordam com as vias de sinalização ativadas classicamente por HSP70, via receptor TLR4, observamos uma nova interação com o receptor dos produtos finais de glicação avançada em um modelo de cultura de células A549 através de sondas fluorescentes. A quantificação do experimento mostrou um maior número de interações quando as células são tratadas com HSP70 na sua conformação ligada à ATP em comparação com o tratamento com HSP70 na sua conformação ligada à ADP; e, através de sucessivos experimentos de docking molecular propusemos um modelo putativo para a interação. Além disso, mostramos que na conformação ligada à ADP, a HSP70 interage preferencialmente com TLR4, de forma similar ao peptídeo MD-2, necessário para o reconhecimento de LPS, sugerindo que a chaperona atue como uma molécula acessória ou como citocina, dependendo do receptor e da situação patológica ou fisiológica. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli and conditions where is common to proteins to suffer the action of oxidative agents. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70. We observed that the Oxidation of HSP70 altered its protein structure; and that macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability. As these results do not concur with the signaling pathways classically activated by HSP70, via TLR4, we observed a new interaction with the receptor for advanced glycation end products through fluorescent probes in a A549 cell culture model. Quantification of the experiment showed a higher number of interactions when cells are treated with HSP70 bound to ATP when compared to the treatment with HSP70 in the conformation ADP-bound; and, by successive molecular docking experiments, we proposed a putative model for such interaction. Moreover, we showed that on its ADP-bound conformation, HSP70 binds preferentially to TLR4, in a similar way as the peptide MD-2, necessary for the recognizing of LPS, suggesting that the chaperone could act as an accessory molecule or as a cytokine, depending on the receptor and physiological or pathological situation.

A expressão da HSP70 intracelular está associada a efeitos citoprotetores contra uma variada gama de estímulos estressores e situações onde é comum que proteínas sofram ação de agentes oxidantes. A HSP70 foi recentemente detectada no meio extracelular, e sua presença tem sido associada a situações patológicas, nas quais ela exerce efeitos modulatórios sobre células do sistema imunológico. Para investigar a possível associação entre HSP70 oxidada e efeitos citoprotetores ou morte celular, macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram incubados com HSP70 e HSP70 oxidada. Observamos que a oxidação da HSP70 alterou a estrutura da proteína; e que os macrófagos tratados com HSP70 oxidada apresentaram menor proliferação, maior produção de espécies reativas de oxigênio, menor atividade fagocítica e menor liberação de TNF-α. Estes resultados indicam que a oxidação da HSP70 extracelular modifica suas propriedades sinalizadoras, causando alterações na modulação das funções e da viabilidade dos macrófagos. Uma vez que estes resultados não concordam com as vias de sinalização ativadas classicamente por HSP70, via receptor TLR4, observamos uma nova interação com o receptor dos produtos finais de glicação avançada em um modelo de cultura de células A549 através de sondas fluorescentes. A quantificação do experimento mostrou um maior número de interações quando as células são tratadas com HSP70 na sua conformação ligada à ATP em comparação com o tratamento com HSP70 na sua conformação ligada à ADP; e, através de sucessivos experimentos de docking molecular propusemos um modelo putativo para a interação. Além disso, mostramos que na conformação ligada à ADP, a HSP70 interage preferencialmente com TLR4, de forma similar ao peptídeo MD-2, necessário para o reconhecimento de LPS, sugerindo que a chaperona atue como uma molécula acessória ou como citocina, dependendo do receptor e da situação patológica ou fisiológica. / Expression of intracellular HSP70 is associated to cytoprotective effects against a wide range extent of stressful stimuli and conditions where is common to proteins to suffer the action of oxidative agents. HSP70 was recently detected in the extracellular medium and its presence in serum is commonly associated with pathological situations, where it exerts modulatory effects on cells of the immune system. To investigate the possible association between oxidized HSP70 and cytoprotection or cell death, we incubated RAW 264.7 macrophages with oxidized HSP70. We observed that the Oxidation of HSP70 altered its protein structure; and that macrophages treated with oxidized HSP70 presented lower proliferation, higher reactive oxygen species production, lower phagocytic activity and TNF-α release. These results indicate that oxidation of extracellular HSP70 modify its signaling properties, causing alterations on its modulatory effects on macrophage function and viability. As these results do not concur with the signaling pathways classically activated by HSP70, via TLR4, we observed a new interaction with the receptor for advanced glycation end products through fluorescent probes in a A549 cell culture model. Quantification of the experiment showed a higher number of interactions when cells are treated with HSP70 bound to ATP when compared to the treatment with HSP70 in the conformation ADP-bound; and, by successive molecular docking experiments, we proposed a putative model for such interaction. Moreover, we showed that on its ADP-bound conformation, HSP70 binds preferentially to TLR4, in a similar way as the peptide MD-2, necessary for the recognizing of LPS, suggesting that the chaperone could act as an accessory molecule or as a cytokine, depending on the receptor and physiological or pathological situation.

O diabetes mellitus (DM) em longo prazo pode levar a diversos problemas entre eles a insuficiência renal, cegueira, alterações vasculares e neurológicas. Entre as teorias que explicam como a hiperglicemia crônica conduz aos danos celulares e teciduais responsáveis pelas complicações observadas no DM, a formação dos produtos finais de glicação avançada (AGEs) é considerada uma das mais importantes. Sabe-se também que nas doenças cardiovasculares, uma das principais complicações do diabetes, ocorre um aumento das quinureninas, produtos de oxidação do triptofano, numa reação catalisada pela enzima Indolamina 2,3 dioxigenase (IDO). Neste trabalho avaliamos a influência dos AGEs sobre a modulação da enzima IDO no estado diabético e seu impacto nos principais marcadores de risco cardíaco. Foi utilizado um modelo experimental de diabates induzido pela injeção i.p. de aloxano em ratos Wistar que foram divididos em 6 grupos (n=8 por grupo): Diabético Ativado (DA), Diabético Não Ativado (DNA), Diabético Ativado tratado com aminoguanidina (DAAG), Diabético Não Ativado tratado com AG (DNAAG), Controle Ativado (CA) e Controle Não Ativado (CNA). A aminoguanidina (AG) é um conhecido inibidor da formação de AGEs e foi administrada por gavagem por 50 dias após a instalação do DM. A formação de quinureninas reflete a atividade de IDO e foi medida em macrófagos peritoneais e homogenato de cérebro, por HPLC. A expressão de IDO foi avaliada por Dot blot, imunofluorescência e imunocitoquímica. Os principais marcadores de risco cardíaco (colesterol total e suas frações e PCR-US) foram determinados através de kits comerciais. Além disso, foi avaliado também o perfil glicêmico e renal destes animais, uma vez que os AGEs são nefrotóxicos. Como esperado, no estado diabético houve um aumento de 2,9 vezes na formação dos AGEs, em relação aos animais controle e a aminoguanidina inibiu cerca de 35% da formação destes produtos. Observamos um aumento na atividade e expressão de IDO em macrófagos e homogenato de cérebro de ratos diabéticos em relação ao controle. O aumento visto em macrófagos foi mais evidente quando estas células foram ativadas pelo LPS, mimetizando uma situação de infecção. Este aumento ocorreu de forma independente da concentração dos AGEs, uma vez que não houve diferença entre os grupos tratatos e não tratados pela AG. Da mesma forma observada para a modulação da IDO, o tratamento com a AG não alterou os perfis glicêmico, lipídico e renal no nosso modelo experimental. Nossos resultados demonstram que o estado hiperglicêmico eleva os níveis de IDO. Estes achados sugerem que IDO pode vir a se tornar um marcador da morbidade do diabetes e potencial alvo em novas estratégias terapêuticas para o DM. / The diabetes mellitus (DM) is a chronic disease that is known to cause several longterm complications such as renal insufficiency, blindness, vascular and neurological changes. There are some theories trying to explain how chronic hyperglycemia may lead to cellular and tissue impairments and the Advanced Glycation End-Products (AGE) theory is one of the most important. Cardiovascular disease is one of the diabetes mellitus long-term complications and in this case it was observed an increased serum concentration of kynurenine, an indoleamine 2, 3 dioxygenase (IDO) catalyzed tryptophan oxidation product. In this study we evaluated the IDO modulation by AGEs in diabetic rats and the impact of this modulation in cardiac risk markers. For diabetes model, Wistar rats were treated with intraperinoeal (i.p.) injection of aloxane. It was evaluated 6 different groups (n=8): Activated diabetic (DA), Non Activated diabetic (DNA), Activated diabetic treated with aminoguanidine (DAAG), Non activated diabetic treated with aminoguanidine (DNAAG), Activated control (CA) and Non activated control (CAN). Aminoguanidine (AG) is a known AGEs formation inhibitor and it was administrated by gavage during 50 days after the DM was installed. Kynurenine formation is a measure of IDO acitivity and it was evaluated, by HPLC, in peritoneal macrophages and brain homogenates. The IDO protein expression was analyzed by Dot Blot, Immunofluorescence and immunocytochemistry. The main cardiac risk markers (total cholesterol and fractions and PCR-US) were determined by commercial kits. The glycemic and renal profile were also evaluated since AGEs are known to be nephrotoxic. As expected, we observed an increase in AGEs by 2,9 times when compared with the control and the aminoguanidine compound inhibited 35% of tthese products. There was an increase in the IDO expression and activity in macrophages and brain homogenates in diabetic rats when compared with control. This rise was more evident when the animals were treated with LPS, mimicking an infection. The difference of IDO activity and expression was not due to the AGEs concentration since we did not observe difference between the AG treated and non-treated groups. The same way observed by IDO modulation, the AG treatment did not alter the glycemic, lipidic and renal profiles in this experimental model. These results showed that the hyperglycemic state increase IDO levels. These findings suggest that IDO might be a morbid diabetes marker and a potential target of new therapeutic strategies of DM. / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG

Durante algumas das reações que levam à formação de AGEs, espécies reativas de oxigênio são geradas e concorrem paralelamente com o estresse oxidativo e com os danos estruturais e funcionais às macromoléculas. A formação de AGEs in vivo pode envolver os neutrófilos, que após estímulo inflamatório, induzem importantes enzimas geradoras de ERO, como o sistema NADPH oxidase. Entretanto ainda permanecem questionamentos sobre a relação entre o Sistema NADPH oxidase de neutrófilos e os AGEs. O presente trabalho visa contribuir para o entendimento do papel do sistema NADPH oxidase e da geração de ERO na formação de AGEs e o impacto da formação destes produtos na função renal destes animais. Foi utilizado um modelo experimental de diabetes induzido pela injeção i.p. de aloxano em ratos Wistar que foram divididos em 5 grupos: controle, diabético, diabético tratado com aminoguanidina (AG), diabético tratado com apocinina (AP) e diabético tratado com apocinina e aminoguanidina (AP+AG). A AG é um conhecido inibidor da formação de AGEs, e a AP é inibidor do sistema NADPH oxidase. Os inibidores, ou água foram administrados aos animais por gavagem por 50 dias após a instalação do DM. A formação de ERO reflete a atividade de NADPH oxidase e foi mensurada em neutrófilos peritoneais por quimiluminescência e pelo ensaio de redução do citocromo C. A expressão das subunidades p47phox e a p67phox do sistema NADPH oxidase foi avaliada por imunofluorescência. Os AGEs circulantes foram avaliados por fluorescência e a função renal foi avaliada pela dosagem da uréia e creatinina séricas e análises histológica dos rins. Pelos parâmetros avaliados neste estudo, verificamos que o tratamento com AP, diminuiu a geração de ERO tanto no grupo controle, quanto diabético, mas não afetou a via de formação de AGEs. O que indica que, provavelmente, não há interrelação entre as vias do sistema da NADPH oxidase de neutrófilos e a formação de AGEs, no nosso modelo experimental. O tratamento com a AP atenuou a glomerulonefrite do grupo diabético. A AG, na dose e no tempo administrado, 100mg/Kg por 50 dias, melhorou o perfil glicêmico dos animais diabéticos, preveniu a formação de AGEs e o dano glomerular. Além disso, o tratamento com a AG aumentou a atividade do sistema NADPH oxidase e a expressão das subunidades citosólicas p47phox e a p67phox do sistema. Não podemos afirmar que o aumento da atividade e expressão do sistema NADPH oxidase seja devido à diminuição dos AGEs no nosso sistema ou um efeito isolado da aminoguanidina, ainda não descrito na literatura. A compreensão do papel desta enzima em modelo experimental de diabetes pode ajudar na compreensão do processo inflamatório persistente que ocorre devido ao acúmulo desses produtos nas complicações da doença, permitindo uma melhor adequação da abordagem clínica e tratamento desses pacientes. / Chronic hyperglycemia observed in diabetes disease leads to the advanced glycation end products (AGEs) formation, which are able to damage the patient organs, especially the kidney. Some AGEs formation reactions may also generate reactive oxygen species (ROS) and they are able to compete with oxidative stress and structural and functional macromolecules damages. Neutrophils are immune cells capable of expressing great amount of important ROS generator enzymes such as NADPH oxidase just after inflammatory stimuli. There are still questions about the relationship between the neutrophil NADPH oxidase system and AGEs despite the information that in vivo AGEs formation may involve neutrophils. The present study aims to contribute to the understanding of NADPH oxidase role and its ROS generation in AGEs formation and what is the impact of these products formation in renal function of rat model. Our experimental diabetes model was reached by alloxan i.p. injection in rats. These animals were divided in five groups: control, diabetic, diabetic treated with aminoguanidine (AG), diabetic treated with apocynin (AP) and diabetic treated with apocynin and aminoguanidine (AG + AP). AG is an AGEs formation inhibitor, and AP is a NADPH oxidase inhibitor. The inhibitors compounds or the vehicle (water) were administered by gavage for 50 days after DM confirmation. ROS formation reflects the NADPH oxidase activity and it was measured by chemiluminescence assay and by cytochrome C reduction in peritoneal neutrophils. The expression of NADPH oxidase p47phox and p67phox subunits was assessed by immunofluorescence. Circulating AGEs were analyzed by fluorescence and the renal function was evaluated by serum urea and creatinin concentration and by kidney histological sections. Our results showed that AP treatment decreased ROS generation in both control and diabetic groups, but did not affect the process of AGEs formation. This may indicate that in our experimental model there is no interrelation between the neutrophil NADPH oxidase system and the AGEs formation. It was also observed that the AP attenuated glomerulonephritis in diabetic mice. AG, at the administered dose and time, 100mg/Kg for 50 dias, improved glycemic control, prevented the AGEs formation and prevented glomerular damage. Furthermore, AG treatment increased the NADPH oxidase activity and its p47phox and p67phox cytosolic subunits expression. We are not able to confirm if the increased activity and expression of NADPH oxidase were caused by the AGEs decrease in our system or by an isolated effect of aminoguanidine not yet described. Understanding the NADPH oxidase role in experimental diabetes could improve the knowledge about the persistent inflammatory process that occurs due to these products accumulation during the disease complication, allowing a better clinical approach and treatment of these patients. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O RAGE é um receptor transmembrana, imunoglobulina-like que existe em múltiplas isoformas e interage com um amplo repertório de ligantes extracelulares. O RAGE é expresso em níveis baixos na maioria das células, porém o aumento da presença de seus ligantes no domínio extracelular faz com que o RAGE inicie uma cascata de sinalização intracelular complexa, resultando em estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição NF-B, aumento da expressão de citocinas, além da indução de sua própria expressão. O envolvimento do RAGE neste amplo espectro de sinalização vincula este receptor a diversas condições patológicas. Nesta tese utilizamos 3 modelos experimentais que induzem inflamação sistêmica (Leishmania amazonensis, Lipopolissacarídeo e sepse) e 1 modelo experimental que mimetiza a denervação neuronal (modelos experimentais in vivo). Além disso utilizamos diferentes abordagens de bloqueio do RAGE a fim de elucidar a função deste receptor. Com base em nossos resultados os modelos experimentais foram eficientes em induzir o aumento do RAGE e sua sinalização no sistema nervoso central, desencadeando a síntese e liberação de moléculas pró-inflamatórias e o aumento do estresse oxidativo, culminando em neuroinflamação e neurodegeneração. As intervenções de bloqueio do RAGE foram eficientes em inibir as vias de sinalização intracelular mediadas pelo receptor, comprovando a via de ação. Levando em conta nossos principais resultados concluímos que: a) RAGE atua como mediador da perda neuronal em resposta ao insulto inflamatório em diversas estruturas do SNC, b) está presente no corpo dos neurônios dopaminérgicos e envolvido na morte destes neurônios; c) o aumento do RAGE é tempo-dependente e a morte dos neurônios está vinculada a ação deste receptor. / RAGE is a transmembrane, immunoglobulin-like receptor that exists in multiple isoforms and interacts with a broad repertoire of extracellular ligands. RAGE is expressed at low levels in most cells, but the increased presence of its ligands initiates a complex intracellular signaling cascade resulting in oxidative stress, activation of transcription factor NF-B, increased expression of cytokines in addition to concomitant upregulation of RAGE itself. In this thesis we used 3 experimental models which induce systemic inflammation (Leishmania amazonensis, Lipopolysaccharide and sepsis) and 1 experimental model that mimics neuronal denervation (experimental models in vivo). In addition, different approaches to block RAGE were used to elucidate the function of this receptor. Based on our results the experimental models were efficient in inducing the increase of RAGE and its signaling in the central nervous system, triggering the synthesis and release of proinflammatory molecules and the increase of oxidative stress, culminating in neuroinflammation and neurodegeneration. The RAGE blocking interventions were effective in inhibiting receptor-mediated signaling, proving the signaling pathway. Considering our main results, we conclude that: a) RAGE acts as a mediator of neuronal loss triggered by inflammatory insults in various CNS structures; b) RAGE is present in the body of dopaminergic neurons and is involved in the death of these neurons; c) the increase of RAGE is time-dependent, and the neuronal death is dependent on the action of this receptor.

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde da Universidade do Extremo Sul Catarinense - UNESC, como requisito parcial para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde. / A meningite bacteriana é uma inflamação das meninges, podendo ser ocasionada pela bactéria Streptococcus pneumoniae que provoca uma intensa resposta imunológica no hospedeiro. Apesar dos avanços, esta doença ainda representa uma grande taxa de mortalidade e de morbidade no mundo inteiro. Os processos inflamatórios ativados durante a meningite pneumocócica aumentam a produção de citocinas e quimiocinas provocando uma cascata de mediadores inflamatórios, bem como a produção de espécies reativas de oxigênio (ERO), culminando na produção aumentada (e deposição) de proteínas amiloides. O aumento da produção e deposição do peptídeo β-amiloide, proporciona locais de ligação adicionais para receptor de produtos finais da glicação avançada (RAGE) nos neurônios e microglia. A interação do receptor RAGE com seu ligante (β-amiloide, por exemplo) é capaz de estimular múltiplas vias de sinalização intracelular, incluindo a ativação e a translocação para o núcleo do fator de transcrição NF-κB, que leva à produção de citocinas, quimiocinas, moléculas pró-inflamatórias, moléculas de adesão e indiretamente o estresse oxidativo. Isso pode levar a lesões neuronais causando prejuízo de memória e aprendizagem, bem como prejuízo a integridade da Barreira Hematoencefálica (BHE). Estratégias terapêuticas sugerem que RAGE é um importante alvo para o tratamento de doenças inflamatórias, visto que a inflamação aumenta a síntese de β-amiloide e regula positivamente RAGE, e a ativação dessa via induz disfunção cognitiva em longo prazo por apoptose neuronal. Recentes estudos sugerem que a inflamação no Sistema Nervoso Central (SNC) pode desempenhar um papel fundamental para o desenvolvimento de doenças neurodegenerativas. Portanto o objetivo deste trabalho foi determinar se a ativação da via β-amiloide-RAGE está associada à disfunção cognitiva em longo prazo em sobreviventes de meningite e se a modulação da inflamação com um inibidor específico de RAGE, o FPS-ZM1 iria melhorar esses efeitos. Em modelo experimental de meningite pneumocócica, foi avaliado a produção de citocinas: Fator de Necrose Tumoral α (TNF-α), interleucina 1β (IL-1β), e Interleucina 6 (IL6); RAGE e proteína do grupo 1 de alta mobilidade (HMGB1); integridade da BHE no hipocampo e no córtex pré-frontal; e também dano na memória de habituação e reconhecimento de objetos novos de ratos Wistar adultos 10 dias após o tratamento com FPS-ZM1. Nos testes a inibição do RAGE com o FPS-ZM1 preveniu a produção destas citocinas no córtex pré-frontal, diminuiu a quebra da BHE em 12, 18 e 24h tanto no hipocampo quanto no córtex, e diminuiu dano cognitivo 10 dias após a indução. Demonstrando um papel importante do RAGE na meningite causada pelo S. pneumoniae, tornando o FPS-ZM1 um possível tratamento adjuvante para esta doença, podendo prevenir danos neurológicos de longo prazo como apresentados na Doença de Alzheimer.

O RAGE é um receptor transmembrana, imunoglobulina-like que existe em múltiplas isoformas e interage com um amplo repertório de ligantes extracelulares. O RAGE é expresso em níveis baixos na maioria das células, porém o aumento da presença de seus ligantes no domínio extracelular faz com que o RAGE inicie uma cascata de sinalização intracelular complexa, resultando em estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição NF-B, aumento da expressão de citocinas, além da indução de sua própria expressão. O envolvimento do RAGE neste amplo espectro de sinalização vincula este receptor a diversas condições patológicas. Nesta tese utilizamos 3 modelos experimentais que induzem inflamação sistêmica (Leishmania amazonensis, Lipopolissacarídeo e sepse) e 1 modelo experimental que mimetiza a denervação neuronal (modelos experimentais in vivo). Além disso utilizamos diferentes abordagens de bloqueio do RAGE a fim de elucidar a função deste receptor. Com base em nossos resultados os modelos experimentais foram eficientes em induzir o aumento do RAGE e sua sinalização no sistema nervoso central, desencadeando a síntese e liberação de moléculas pró-inflamatórias e o aumento do estresse oxidativo, culminando em neuroinflamação e neurodegeneração. As intervenções de bloqueio do RAGE foram eficientes em inibir as vias de sinalização intracelular mediadas pelo receptor, comprovando a via de ação. Levando em conta nossos principais resultados concluímos que: a) RAGE atua como mediador da perda neuronal em resposta ao insulto inflamatório em diversas estruturas do SNC, b) está presente no corpo dos neurônios dopaminérgicos e envolvido na morte destes neurônios; c) o aumento do RAGE é tempo-dependente e a morte dos neurônios está vinculada a ação deste receptor. / RAGE is a transmembrane, immunoglobulin-like receptor that exists in multiple isoforms and interacts with a broad repertoire of extracellular ligands. RAGE is expressed at low levels in most cells, but the increased presence of its ligands initiates a complex intracellular signaling cascade resulting in oxidative stress, activation of transcription factor NF-B, increased expression of cytokines in addition to concomitant upregulation of RAGE itself. In this thesis we used 3 experimental models which induce systemic inflammation (Leishmania amazonensis, Lipopolysaccharide and sepsis) and 1 experimental model that mimics neuronal denervation (experimental models in vivo). In addition, different approaches to block RAGE were used to elucidate the function of this receptor. Based on our results the experimental models were efficient in inducing the increase of RAGE and its signaling in the central nervous system, triggering the synthesis and release of proinflammatory molecules and the increase of oxidative stress, culminating in neuroinflammation and neurodegeneration. The RAGE blocking interventions were effective in inhibiting receptor-mediated signaling, proving the signaling pathway. Considering our main results, we conclude that: a) RAGE acts as a mediator of neuronal loss triggered by inflammatory insults in various CNS structures; b) RAGE is present in the body of dopaminergic neurons and is involved in the death of these neurons; c) the increase of RAGE is time-dependent, and the neuronal death is dependent on the action of this receptor.

O RAGE é um receptor transmembrana, imunoglobulina-like que existe em múltiplas isoformas e interage com um amplo repertório de ligantes extracelulares. O RAGE é expresso em níveis baixos na maioria das células, porém o aumento da presença de seus ligantes no domínio extracelular faz com que o RAGE inicie uma cascata de sinalização intracelular complexa, resultando em estresse oxidativo, ativação do fator de transcrição NF-B, aumento da expressão de citocinas, além da indução de sua própria expressão. O envolvimento do RAGE neste amplo espectro de sinalização vincula este receptor a diversas condições patológicas. Nesta tese utilizamos 3 modelos experimentais que induzem inflamação sistêmica (Leishmania amazonensis, Lipopolissacarídeo e sepse) e 1 modelo experimental que mimetiza a denervação neuronal (modelos experimentais in vivo). Além disso utilizamos diferentes abordagens de bloqueio do RAGE a fim de elucidar a função deste receptor. Com base em nossos resultados os modelos experimentais foram eficientes em induzir o aumento do RAGE e sua sinalização no sistema nervoso central, desencadeando a síntese e liberação de moléculas pró-inflamatórias e o aumento do estresse oxidativo, culminando em neuroinflamação e neurodegeneração. As intervenções de bloqueio do RAGE foram eficientes em inibir as vias de sinalização intracelular mediadas pelo receptor, comprovando a via de ação. Levando em conta nossos principais resultados concluímos que: a) RAGE atua como mediador da perda neuronal em resposta ao insulto inflamatório em diversas estruturas do SNC, b) está presente no corpo dos neurônios dopaminérgicos e envolvido na morte destes neurônios; c) o aumento do RAGE é tempo-dependente e a morte dos neurônios está vinculada a ação deste receptor. / RAGE is a transmembrane, immunoglobulin-like receptor that exists in multiple isoforms and interacts with a broad repertoire of extracellular ligands. RAGE is expressed at low levels in most cells, but the increased presence of its ligands initiates a complex intracellular signaling cascade resulting in oxidative stress, activation of transcription factor NF-B, increased expression of cytokines in addition to concomitant upregulation of RAGE itself. In this thesis we used 3 experimental models which induce systemic inflammation (Leishmania amazonensis, Lipopolysaccharide and sepsis) and 1 experimental model that mimics neuronal denervation (experimental models in vivo). In addition, different approaches to block RAGE were used to elucidate the function of this receptor. Based on our results the experimental models were efficient in inducing the increase of RAGE and its signaling in the central nervous system, triggering the synthesis and release of proinflammatory molecules and the increase of oxidative stress, culminating in neuroinflammation and neurodegeneration. The RAGE blocking interventions were effective in inhibiting receptor-mediated signaling, proving the signaling pathway. Considering our main results, we conclude that: a) RAGE acts as a mediator of neuronal loss triggered by inflammatory insults in various CNS structures; b) RAGE is present in the body of dopaminergic neurons and is involved in the death of these neurons; c) the increase of RAGE is time-dependent, and the neuronal death is dependent on the action of this receptor.

Um dos principais fatores patogênicos do quadro de resistência à insulina é a deficiência na expressão de Slc2a4/GLUT4 que, ao longo prazo, causa perda da homeostasia glicêmica. Além disso, a hiperglicemia constante leva a uma glicotoxicidade que também contribui para a patogênese desse quadro. O aumento da glicose circulante leva à formação de produtos finais de glicação avançada (AGEs) que, ao interagem com seu receptor RAGE, desencadeiam processos inflamatórios e estresse oxidativo e de retículo na célula, culminando na ativação da via do NFKB, fator transcricional conhecido por ser repressor da expressão do gene Slc2a4. Nesse sentido, o objetivo do presente estudo visou investigar os efeitos dos AGEs na expressão de Slc2a4/GLUT4 e se esse efeito é mediado pela ativação da via do NFKB. Para isso, utilizamos adipócitos da linhagem 3T3-L1 tratados com albumina sérica bovina sem modificações ou conjugada com glicolaldeído e verificamos a expressão dos genes Slc2a4, Nfkb1 e Rela, a abundância das proteínas GLUT4, p65 e p50, o grau de fosforilação das proteínas IKK alfa e IKK beta e a atividade de ligação da subunidade p65 no promotor do gene Slc2a4. Os resultados indicaram que a albumina glicada é capaz de modular a expressão de Slc2a4/GLUT4 de maneira hormética, isto é, em concentração baixa (0,4 mg/mL) e tempo curto (24 horas), houve um aumento na expressão do gene e da proteína, porém, há uma redução da expressão do gene e da proteína quando em concentração alta (5,4 mg/mL) e tempo prolongado (72 horas). Além disso, a albumina glicada induz atividade pró-inflamatória no adipócito e aumento da quantidade de p65 e p50 no núcleo em concentração alta e tempo prolongado. No entanto, a ativação da via do NFKB não se dá pela via canônica, pois não foi observado ativação de IKK. Por fim, apesar de ser um dado preliminar, a albumina glicada induz aumento de ligação do NFKB na região promotora do gene Slc2a4. Em suma, o presente estudo demonstra que os AGEs participam não só da gênese das complicações degenerativas presentes no diabetes mellitus, como também, contribui ativamente para a perda da homeostasia glicêmica. / One of the main pathogenic factors of the insulin resistance is the deficiency in the expression of Slc2a4/GLUT4, which in the long term causes impaired glucose homeostasis. In addition, constant hyperglycemia leads to a glycotoxicity that also contributes to the pathogenesis of this condition. Increased circulating glucose leads to the formation of advanced glycated end products (AGEs) which, when interacting with RAGE receptor, trigger inflammatory processes and oxidative and reticulum stress in the cell, culminating in the activation of the NFKB pathway. This transcriptional factor is a known repressor of the Slc2a4 gene. In this sense, the objective of the present study was to investigate the effects of AGEs on the expression of Slc2a4/GLUT4 and whether this effect is mediated by the activation of the NFKB pathway. For this, we used 3T3-L1 adipocytes treated with bovine serum albumin without modification or conjugated with glycolaldehyde and verified the expression of the genes Slc2a4, Nfkb1 and Rela, abundance of GLUT4, p65 and p50 proteins, the degree of phosphorylation of IKK alpha and IKK beta proteins and p65 subunit binding activity in the Slc2a4 gene promoter. The results indicated that glycated albumin is able to modulate the expression of Slc2a4/GLUT4 in a hormetic manner, i.e. at low concentration (0.4 mg/mL) and short time (24 hours), there was an increase in gene expression and protein. However, there is a reduction of the gene and the protein expression when in high concentration (5.4 mg/mL) and prolonged time (72 hours). In addition, glycated albumin induces proinflammatory activity in the adipocyte and increases the amount of p65 and p50 in the nucleus in high concentration and prolonged time. Nonetheless, the activation of the NFKB pathway does not occur through canonical pathway, since no IKK activation was observed. Finally, despite being a preliminary finding, glycated albumin induces increased NFKB binding in the promoter region of the Slc2a4 gene. In summary, the present study demonstrates that AGEs participate not only in the genesis of the degenerative complications present in diabetes mellitus, but also contributes actively to the loss of glycemic homeostasis.