Hematopoietic stem cells (HSCs) are rare cells that continuously regenerate the entire hematopoietic system by producing billions of blood cells. Dormant HSCs (dHSCs) represent a distinct subpopulation of HSCs characterized by deep quiescence and very low overall biosynthetic activity. Despite this, dHSCs have the highest reconstitution and self-renewal potential and reside at the apex of the hematopoietic hierarchy. While dHSCs do not significantly contribute to daily blood cell production under steady-state conditions, they can be reversibly activated in response to inflammatory signals or blood loss. Thus, dHSCs serve as a reserve pool of HSCs during the entire life. Insufficient dormancy can subject dHSCs to replication stress and promote the accumulation of somatic mutations, increasing the risk of their exhaustion or malignant transformation. Conversely, excessive dormancy can limit normal blood cell production, potentially resulting in bone marrow failure. Therefore, further investigations exploring the mechanisms controlling HSC dormancy are required, as this knowledge is essential for developing novel therapeutic interventions for supporting blood production following chemotherapy or HSC transplantation. Progress in dHSC research has been impeded by technical difficulties associated with isolating these cells. Current methods include either label retention assay, which is very time-consuming, or the use specialized reporter mouse strains that are not readily available. Herein, we utilized single-cell RNA sequencing of HSCs to identify potential surface markers which would facilitate the direct isolation of dHSCs using fluorescence-activated cell sorting (FACS). We selected CD38 as a candidate gene and confirmed that its high expression levels in LT-HSCs, the most functional HSCs identified by the latest surface phenotype, correspond to the dormant subpopulation. Namely, we employed four techniques (staining for cell cycle, label incorporation assay, label retention assay, and single-cell division tracking assay) and demonstrated that CD38+ HSCs are the most quiescent among LT-HSCs. Additionally, through serial competitive transplantation into lethally irradiated mice, we compared CD38+ and CD38- LT-HSCs and discovered that CD38+ LT-HSCs have superior repopulation and self-renewal capacities compared to CD38- LT-HSCs. Thus, we concluded that CD38 is a marker for dHSCs in mice. Besides, we applied the models of hematopoietic stress – acute thrombocytopenia, injection of viral mimetic polyinosinic:polycytidylic acid, and the chemotherapeutic agent 5-fluorouracil, and showed that high expression levels of CD38 on LT-HSCs define dHSCs both in homeostasis and under stress conditions. Notably, we showed that CD38 is not only a marker but also has a functional role in mediating HSC dormancy. Using CD38 knock-out mice, small molecule inhibitor for CD38 enzymatic activity, in vitro assays, bulk RNA sequencing, and confocal microscopy, we discovered a previously unknown signaling axis that promotes HSC dormancy via CD38 enzymatic activity. We demonstrated that second messenger cADPR, synthesized by CD38 through the conversion of nicotinamide adenine dinucleotide - NAD+, elevates free cytoplasmic Ca2+ in dHSCs. This elevation induces the expression of the transcription factor c-Fos. Subsequently, c-Fos forms complexes with the Smad2/3, ultimately promoting dHSC quiescence in p57Kip2-dependent manner. Thus, we revealed that CD38/cADPR/Ca2+/c-Fos-Smad2/3/p57kip2 axis supports dHSCs. Human HSCs (hHSC) are defined as CD38lo/- ; however, CD38 is expressed by various immune cell types present in human bone marrow, such as B-lymphocytes, T-lymphocytes, NK-cells, neutrophils and monocytes. Our co-culture experiments of hHSCs with CD38+ cells and human bone marrow imaging suggest that CD38 promotes hHSC quiescence, however indirectly, in a paracrine manner. Besides, several hematological malignancies (e.g. multiple myeloma, chronic lymphocytic leukemia, acute myeloid leukemia) express CD38 at a high level. We hypothesize that tumor microenvironment enriched in the products of CD38 ecto-enzymatic activity may suppress the cell cycle of healthy hHSCs leading to cancer-related pancytopenia. Therefore, inhibiting CD38-mediated cADPR production might support healthy hematopoiesis in patients with hematologic malignancies. In summary, while CD38/Ca2+ and c-Fos have individually been implicated in proliferation in other cell types, our study for the first time reveals their role in promoting HSC dormancy in collaboration with well-known mediators of HSC quiescence Smad2/3 and p57Kip2. Therefore, we gathered the pieces of the puzzle together and discovered the novel CD38 enzymatic activity-driven signaling pathway controlling HSC dormancy. Manipulation of this axis can potentially stimulate an efficient dHSC response to hematopoietic stress. / Hämatopoetische Stammzellen (HSZ) sind seltene Zellen, die das gesamte blutbildende System kontinuierlich regenerieren, indem sie Milliarden von Blutzellen produzieren. Ruhende HSZ (rHSZ) stellen eine besondere Subpopulation von HSZ dar, die sich durch tiefe Ruhephasen und eine sehr geringe Biosyntheseaktivität auszeichnet. Trotzdem haben rHSZ das höchste Rekonstitutions- und Selbsterneuerungspotenzial und stehen an der Spitze der hämatopoetischen Hierarchie. Während rHSZs unter Normalbedingungen nicht wesentlich zur täglichen Blutzellproduktion beitragen, können sie als Reaktion auf Entzündungssignale oder Blutverlust reversibel aktiviert werden. Somit dienen rHSZ während des gesamten Lebens als HSZ-Reservoir. Eine gestörte Ruhe der rHSZs kann die Zellen einem Replikationsstress aussetzen und die Anhäufung somatischer Mutationen fördern, was das Risiko für Zellerschöpfung oder maligne Transformation erhöht. Umgekehrt kann eine übermäßige Ruhephase die normale Blutzellproduktion einschränken und möglicherweise zu Knochenmarksversagen führen. Daher ist eine weitere Erforschung der Mechanismen erforderlich, die die HSZ-Ruhephase steuern, da dieses Wissen für die Entwicklung neuartiger therapeutischer Maßnahmen zur Unterstützung der Blutproduktion nach einer Chemotherapie oder HSZ-Transplantation unerlässlich ist. Der Fortschritt in der rHSZ-Forschung wurde durch technische Schwierigkeiten bei der Isolierung dieser Zellen behindert. Zu den derzeitigen Methoden gehören entweder der sehr zeitaufwändige Label-Retentionstest oder die Verwendung spezieller Reportermausstämme, die nicht ohne Weiteres verfügbar sind. In dieser Arbeit haben wir die Einzelzell-RNA-Sequenzierung von HSZs genutzt, um potenzielle Oberflächenmarker zu identifizieren, die die direkte Isolierung von rHSZs mittels fluoreszenzaktivierter Zellsortierung (FACS) erleichtern würden. Wir wählten CD38 als Kandidatengen aus und überprüften, dass dessen hohe Expression auf den funktionellsten HSZ (LT-HSZ), welche mit dem neuesten Oberflächenphänotyp isoliert wurden, die ruhenden Subpopulation identifizieren kann. Wir haben vier Techniken angewandt (Färbung für den Zellzyklus, Label-Inkorporationstest, Label-Retentionstest und Einzelzellteilungstest) und gezeigt, dass CD38+ HSZ die am tiefsten ruhenden LT-HSZs sind. Darüber hinaus haben wir durch serielle konkurrierende Transplantation in letal bestrahlte Mäuse CD38+ und CD38- LT-HSZs verglichen und festgestellt, dass CD38+ LT-HSZs im Vergleich zu CD38- LT-HSZs eine höhere Wiederbesiedlungs- und Selbsterneuerungskapazität haben. Daraus schlossen wir, dass CD38 ein Marker für rHSZs in Mäusen ist. Außerdem wendeten wir Modelle für hämatopoetischen Stress an - akute Thrombozytopenie, Injektion des viralen Mimetikums Polyinosin:Polycytidylsäure und des Chemotherapeutikums 5-Fluorouracil - und zeigten, dass eine hohe Expressionsrate von CD38 auf LT-HSZs rHSZs sowohl in Homöostase als auch unter Stressbedingungen definiert. Besonders bemerkenswert ist, dass wir zeigen konnten, dass CD38 nicht nur ein Marker ist, sondern auch eine funktionelle Rolle bei der Vermittlung der HSZ-Ruhe spielt. Mithilfe von CD38-Knock-out-Mäusen, kleinen Molekül-Inhibitoren für die CD38-Enzymaktivität, In-vitro-Tests, Massen-RNA-Sequenzierung und konfokaler Mikroskopie entdeckten wir eine bisher unbekannte Signalachse, die die HSZ-Ruhe über die enzymatische Aktivität von CD38 fördert. Wir konnten nachweisen, dass der sekundäre Botenstoff cADPR, der von CD38 durch die Umwandlung von Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) synthetisiert wird, das freie zytoplasmatische Ca2+ in rHSZs erhöht. Diese Erhöhung induziert die Expression des Transkriptionsfaktors c-Fos. Anschließend bildet c-Fos Komplexe mit Smad2/3 und fördert schließlich die Ruhe der rHSZ in Abhängigkeit von p57Kip2. Wir konnten also zeigen, dass die CD38/cADPR/Ca2+/c-Fos-Smad2/3/p57kip2-Achse rHSZs unterstützt. Humane HSZ (hHSZ) werden als CD38lo/- definiert; CD38 wird jedoch von verschiedenen Immunzellarten im menschlichen Knochenmark exprimiert, z. B. von B-Lymphozyten, T-Lymphozyten, NK-Zellen, Neutrophilen und Monozyten. Unsere Co-Kulturexperimente von hHSZs mit CD38+-Zellen und die Bildgebung des menschlichen Knochenmarks deuten darauf hin, dass CD38 die Ruhe von hHSZs fördert, wenn auch indirekt auf parakrine Weise. Außerdem exprimieren mehrere hämatologische Malignome (z. B. multiples Myelom, chronische lymphatische Leukämie, akute myeloische Leukämie) CD38 in hohem Maße. Wir stellen die Hypothese auf, dass die Mikroumgebung des Tumors, die mit den Produkten der ektoenzymatischen Aktivität von CD38 angereichert ist, den Zellzyklus gesunder hHSZs unterdrücken kann, was zu krebsbedingter Panzytopenie führt. Daher könnte die Hemmung der CD38-vermittelten cADPR-Produktion die gesunde Hämatopoese bei Patienten mit hämatologischen Malignomen unterstützen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass CD38/Ca2+ und c-Fos zwar bereits einzeln für die Proliferation in anderen Zelltypen verantwortlich gemacht wurden, unsere Studie jedoch zum ersten Mal ihre Rolle bei der Förderung der HSZ-Ruhe in Zusammenarbeit mit den bekannten Mediatoren der HSZ-Ruhe Smad2/3 und p57Kip2 aufzeigt. Wir haben also die Teile des Puzzles zusammengefügt und den neuartigen, von der enzymatischen Aktivität von CD38 gesteuerten Signalweg entdeckt, der die HSZ-Ruhephase kontrolliert. Die Manipulation dieser Achse kann möglicherweise eine effiziente rHSZ-Reaktion auf hämatopoetischen Stress stimulieren.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:90428 |
| Date | 04 June 2024 |
| Creators | Ibneeva, Liliia |
| Contributors | Wielockx, Benjamin, Bonifacio, Ezio, Technische Universität Dresden |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | English |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3002517 |
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