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Previous issue date: 2010 / Fundação Oswaldo Cruz.Instituto Oswaldo Cruz. Rio de janeiro, RJ, Brasil / Os vírus da hepatite B (HBV) e da hepatite C (HCV) são os maiores agentes causadores de
doenças hepáticas crônicas. As vacinas recombinantes contra a hepatite B correspondem ao
antígeno de superfície do vírus da hepatite B (HBsAg), formado apenas pela proteína small
(S), as quais têm a propriedade de organizar-se em partículas subvirais não infecciosas
secretadas em grande quantidade pelas células hospedeiras sendo facilmente purificadas. As
partículas subvirais do HBV podem funcionar como uma estrutura carreadora de epítopos de
outros agentes infecciosos e devido a essas propriedades, foram construídos plasmídios
recombinantes contendo o gene S do HBV, no qual foi inserido uma sequencia de 129bp da
região E2 hipervariável 1 (HVRI) do envelope do HCV, através de um sítio de restrição único
localizado no interior da região nucleotídica para o determinante a do HBsAg. O objetivo
deste estudo é a caracterização desses vetores HBsAg subvirais carregando epitopos do HCV,
com avaliação de antigenicidade e imunogenicidade das construções plasmidiais, bem como
das partículas quiméricas purificadas em comparação a partículas HBsAg subvirais. Três
vetores de expressão em células de mamíferos comerciais, pcDNA3.1D/V5-His-TOPO
©
, o
pcDNA3 e o pCI foram utilizados e os ensaios de transfecção transitória realizados em células
de ovário de hamster chinês (CHO) e/ou células hepáticas de linhagem contínua humana
(HuH7). A avaliação da presença de uma cauda de poli-histidina fusionada ao HBsAg foi
realizada em construções utilizando como vetor o plasmídio comercial pCI. Os sobrenadantes
e extratos celulares obtidos das transfecções transitórias foram analisados quanto à detecção
de HBsAg por ensaios imunoenzimáticos. As proteínas recombinantes obtidas foram pré-purificadas por colchão de sacarose 20%, caracterizadas por eletroforese em gel de
poliacrilamida desnaturante (SDS-PAGE) e Western-Blot e os ensaios de imunogenicidade
foram realizados em camundongos BALB/c de 4 semanas. Os níveis de expressão transitória
de partículas HBsAg subvirais expressas nas células CHO e HuH7 foram duas vezes menores
utilizando o vetor pCI contendo a sequencia para poli-histidinas em comparação com o vetor
pCI comercial. O perfil em SDS-PAGE evidenciou duas bandas protéicas de 30 kDa e 24
kDa, presentes somente nos sobrenadantes das culturas transfectadas transitoriamente e não
nos controles negativos. Tais bandas foram reconhecidas em Western-Blot, por um anticorpo
monoclonal anti-HBs específico para a proteína S, corroborando a antigenicidade da proteína
HBsAg quimérica (30kDa) e não quimérica (24kDa). Os ensaios de imunogenicidade em
camundongos BALB/c demonstraram que a vacinação com as construções moleculares
contendo o gene HBsAg (pCI-SAa) ou a sequencia quimérica HBsAg/HCV (pCI-SAaHCV)
foi capaz de elicitar uma resposta imune humoral, com uma detecção de anticorpos anti -HBs
cerca de 3 e 400 vezes, respectivamente, maior do que detectada nos camundongos
imunizados com as partículas HBsAg subvirais obtidas pelas mesmas construções
plasmidiais. O desenvolvimento dessa tecnologia se torna uma ferramenta útil para a produção de vacinas bivalentes, como insumos para testes de diagnóstico ou ainda como agente terapêutico / The hepatitis B virus (HBV) and hepatitis C virus (HCV) are the major causative agents of chronic hepatitis disease worldwide. The HBV recombinant vaccines are composed of the
HBV small (S) envelope protein(HBsAg).These particles have the capacity of self-assemble
into virus-like particles (VLPs), which can be produced in large quantities and are easily
enriched and purified. Nevertheless, the HBsAg subviral particles may be used as a carrier for
foreign epitopes. Due to this property we have constructed HBsAg recombinant plasmids
from a HBV isolate of genotype A, subgenotype A1, which we have used to insert epitopes of
the E2 hypervariable region 1 (HVR1) from HCV envelope protein, using a natural unique
restriction site located into the a determinant of S region. The aim of this study is to characterize these chimeric subviral HBsAg vectors carrying HCV epitopes, to evaluate the antigenicity and immunogenicity of molecular constructions, as well as, the purified chimeric
particles compared with HBsAg subviral particles. The chimeric HBsAg/HCV and wild type HBsAg sequences were cloned into three different mammalian commercial vectors, the
pcDNA3.1D/V5-His-TOPO©, pcDNA3 and pCI. Transient transfection assays were carried
out in Chinese Ramster Ovary (CHO) and Human Hepatoma (HuH7) cell lines. The
evaluation of a poly-histidine tag fused to HBsAg sequence was performed using pCI vector constructions. The detection of HBsAg from medium and cells extracts of the transient
transfection cell lines were analysed by immunosorbent assay. The recombinant proteins were
partially purified by 20% sucrose cushion, characterized by sodium dodecyl sulfate
polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and Western-Blot analysis. The
immunogenicity assays were performed with Male 4-week-old BALB/c mice. The expression
patterns of HBsAg particles expressed by CHO and HuH7 cell lines were 2-fold lower in pCI
vectors fused with a poly-histidine tag than commercial pCI vectors. The SDS-PAGE profile
showed two protein bands of 30 kDa and 24 kDa at culture medium of transfected cells,
which were absent at negative controls. These bands were detected in Western Blot assay,
using a specific anti-HBs monoclonal antibody S protein, and corroborates the chimeric
HBsAg (30 kDa) and wild type HBsAg (24 kDa) antigenicity. The immunogenicity assays
performed at BALB/c mice showed the vaccination with molecular constructions, containing
the HBsAg wild type (pCI-SAa) or chimeric HBsAg/HCV (pCI-SAaHCV) sequences, were
able to elicit a humoral immune response, with anti-HBs antibodies titers about 3 to 400-fold
higher than detected in mice immunized with wild type and chimeric HBsAg/HCV purified
particles, obtained with the same molecular constructions. This study has practical
applications, such as the development of bivalents vaccines, therapy, as well as, diagnosis fields.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.arca.fiocruz.br:icict/6268 |
| Date | January 2010 |
| Creators | Vieira, Monique Branco |
| Contributors | Moraes e Souza, Márcia Terezinha Baroni de, Martins, Regina Maria Bringel, Costa, Simone Morais da, Araujo, Natalia Motta de, Gomes, Selma de Andrade |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Repositório Institucional da FIOCRUZ, instname:Fundação Oswaldo Cruz, instacron:FIOCRUZ |
| Rights | Monique Branco Vieira, info:eu-repo/semantics/openAccess |
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