Saccharomyces cerevisiae mielės yra vienas plačiausiai rekombinantinių baltymų gamybai, todėl šio darbo metu buvo kuriamos mielių S. cerevisiae raiškos sistemos, skirtos sintetinti tioredoksino geną arba gliukozės dehidrogenazės geną sujungtą su Abeta peptidu. Atrinkus stabilius hibridinių baltymų producentus, jie buvo auginami įvairiose kultyvavimo terpėse, keičiant temperatūrą bei indukcijos laiką. Tokiu būdu parenkamos optimalios kultūrų auginimo sąlygos, užtikrinančios didžiausias gaminamo baltymo kiekius. Šio darbo metu sukonstruoti mielių raiškos vektoriai, kuriuose hibridinių baltymų - tioredoksino sujungto su Abeta peptidu (Trx-ab) bei ir gliukozės dehidrogenazės sujungtos su Abeta peptidu (GDH-ab) - raiška yra reguliuojama galaktoze indukuojamu GAL-CYC1 promotoriumi. Atlikus sėkmingą Saccharomyces cerevisiae 21PMR mielių kamieno transformaciją rekombinantinėmis plazmidėmis, atrinkti optimalūs heterologinių baltymų gamintojai. Ištyrus sukonstruotas DNR plazmides, nustatytas didelis (90-95%) auksotrofinių markerių stabilumas ir tik apie 50% Trx-ab arba GDH-ab genų išsilaikymas mielėse. Sukonstruotos viduląstelinės ir ekstraląstelinės mielių ekspresijos sistemos, užtikrinančios tioredoksino sujungto su Abeta peptidu sintezę. Optimizuotos mielių auginimo sąlygos bei baltymų gryninimo procedūros ir nustatyta, kad didžiausias hibridinio darinio lygis stebimas viduląstelinio gamintojo citoplazminėje frakcijoje. Ištirti gliukozės dehidrogenazės geno bei hibridinio darinio... [toliau žr. visą tekstą] / The principal advantages of S. cerevisiae yeast to express recombinant proteins was used to study expression peculiarities of the fused bacterial thioredoxin or glucose dehydrogenase genes with Abeta peptide sequence. In the next step of this work we investigated the growth conditions of stabily persisting yeast transformants in order to achieve a maximal production of the hybrid proteins. In the present work yeast expression vectors bearing either thioredoxin-encoding gene fused with Abeta peptide (Trx-ab) or its mutant sequence or glucose dehydrogenase gene fused with Abeta (GDH-ab) under the control of galactose-inducible GAL-CYC1 promoter were constructed. After successful transformation of yeast Saccharomyces cerevisiae strain 21PMR the eukaryotic producents of the hybrid proteins were isolated. Analysis of stability of heterologous expression plasmids indicated 90-95% maintenance of auxotrofic markers and only 50% - that of Trx-ab or GDH-ab genes. Intracellular and extracellular yeast expression system were designed to ensure synthesis of tioredoxin fused with Abeta peptide. Optimization of yeast cultivation conditions and purification procedures showed that the highest level of hybrid protein is observed in the cytoplasmic fraction of intracellular producent. Expression pecularities of the glucose dehydrogenase gene and its hybrid, bearing an additional Abeta peptide sequence, controlled by constitutive ADH1 and galactose-inducible GAL-CYC1 promoters in yeast S... [to full text]
| Identifer | oai:union.ndltd.org:LABT_ETD/oai:elaba.lt:LT-eLABa-0001:E.02~2009~D_20101125_190733-91778 |
| Date | 25 November 2010 |
| Creators | Kolendaitė, Rasa |
| Contributors | Servienė, Elena, Vilnius University |
| Publisher | Lithuanian Academic Libraries Network (LABT), Vilnius University |
| Source Sets | Lithuanian ETD submission system |
| Language | Lithuanian |
| Detected Language | Unknown |
| Type | Master thesis |
| Format | application/pdf |
| Source | http://vddb.laba.lt/obj/LT-eLABa-0001:E.02~2009~D_20101125_190733-91778 |
| Rights | Unrestricted |
Page generated in 0.002 seconds