Tesis por compendio de publicaciones / Los cítricos son uno de los principales cultivos a nivel mundial, pero su producción se ve reducida por diferentes tipos de estrés. Entre ellos, la salinidad es el que probablemente causa un mayor impacto, principalmente en zonas áridas y semiáridas que son las zonas principales de producción de cítricos. La mejora de patrones de cítricos mediante métodos tradicionales se encuentra limitada por factores relacionados con su biología reproductiva. Como alternativa, el desarrollo de herramientas biotecnológicas como la mutagénesis, en combinación con el cultivo de tejidos, deberían ser consideradas como valiosas estrategias para abordar la mejora genética de estas especies. En el presente trabajo, se ha desarrollado por primera vez un protocolo simple y eficaz de micropropagación, a partir de material adulto, de tres importantes patrones de cítricos. Si bien existen diferencias debidas al genotipo, fueron indispensables, para la multiplicación de los explantos, medios con alta concentración salina, como DKW o MS, y diferentes combinaciones de BA y GA o BA y AD. Durante la fase de enraizamiento, la adición de auxinas ha sido esencial, si bien mientras que en Macrophylla, los mejores resultados se obtuvieron con combinaciones de IBA e IAA, en Naranjo amargo y Cleopatra, se obtuvieron con IBA y NAA. La aclimatación de los explantos fue casi del 100% para todos los patrones estudiados. Este protocolo podría ser usado para la producción de plantas de patrones de cítricos certificadas y como fuente de material aséptico y genéticamente homogéneo para estudios de comportamiento frente a diferentes estreses y para su uso en programas de mejora genética mediante mutagénesis o transformación. La evaluación del comportamiento de los cultivos en campo bajo condiciones salinas es realmente complicada debido a la variabilidad de la salinidad y a la importante interacción que se produce con otros factores ambientales. El cultivo de tejidos ofrece una alternativa eficaz para el estudio de los mecanismos implicados en la tolerancia a la salinidad, ya que proporciona una respuesta relativamente rápida en un ambiente controlado. Se analizó la respuesta a la salinidad de explantos de Macrophylla en proliferación o en enraizamiento. La tasa de crecimiento de los explantos disminuyó con el aumento de la concentración de NaCl en el medio de cultivo en los dos tipos de explantos. A nivel fisiológico, la concentración total de clorofila disminuyó de manera significativa con la sal, y este efecto fue más significativo en los explantos enraizados. Para contrarrestar el daño por la sales, los explantos respondieron mediante la síntesis y acumulación de sustancias osmoprotectoras como prolina y glicina betaína. La concentración de Na+ y Cl- en los explantos de Macrophylla aumentó de manera significativa con la salinidad, pero los niveles fueron más altos en los explantos en proliferación. Los resultados obtenidos sugieren que los importantes daños sufridos en los explantos se deben principalmente a la toxicidad celular de los iones salinos, principalmente al Cl-. Se ha desarrollado un sistema eficiente de organogénesis in vitro, para explantos nodales adultos de Macrophylla y Naranjo amargo, que podría ser utilizado para la introducción de variación genética a través de transformación o mutagénesis. El protocolo fue optimizado variando la concentración de los reguladores del crecimiento, las condiciones de incubación, el medio basal y el tipo de explanto usado. La adición de BA (2-3 mg/l) y el periodo de inducción en oscuridad (3-4 semanas) fueron indispensables para la regeneración de los explantos y el tipo de explanto o el medio basal tuvieron una gran influencia. Los mejores resultados fueron obtenidos con segmentos nodales, frente al uso de segmentos internodales, y la eficiencia organogénica fue superior cuando se utilizaron explantos de la zona apical del brote. / Citrus fruits are regarded as the major culture around the world, but citrus production is limited by abiotic stress. Among them, salinity is probably the most impacting adverse condition, mainly in arid and semiarid regions, where citrus are produced. The improvement of Citrus rootstock via conventional breeding strategies is normally hampered by several factors related to their reproductive biology, such as large tree size, polyembryony, high level of heterozygosity, and long juvenile period. As alternatives, biotechnological techniques, such as plant tissue culture in combination with mutagenesis, should be looked on as valuable strategies for improvement of Citrus rootstocks. In the present work, has been developed a simple and useful methods of micropropagation from mature plants of alemow, Sour orange and Cleopatra mandarin, by optimization of culture medium (nutrients salts and growth regulators), since introduction of plant material, multiplication and rooting in vitro to acclimatization ex vitro. In general, although differences due to the genotype were observed, in all rootstocks, best results in micropropagation phase were obtained in DKW-based culture medium in combination with BA and GA. In the rooting stage, IBA and IAA combinations for alemow, and NAA and IBA for Cleopatra mandarin or Sour orange produced highest rooting percentages. Success during acclimatization was close to 100 % for all rootstocks. These micropropagated explants could be used for the production of certified citrus rootstocks plants and as an ideal source of aseptic and homogeneous material for different transformation or mutagenesis experiments, and the protocol of micropropagation described in this study can be easily applied for the effective propagation of genetically modified plants. Evaluating field performance crops under saline conditions is notoriously difficult because of the variability of salinity within fields and the enormous potential for interactions with other environmental factors. In vitro tissue culture is a simple system that offers a suitable alternative to studying physiological mechanisms of tolerance to salinity, since it provides relatively fast responses, a short generation time and a controlled environment. In the present study, the possible use of in vitro culture to evaluate the growth and physiological responses to salt-induced stress in cultivated explants of alemow was analyzed. All growth parameters were decreased significantly by these NaCl treatments. At physiological level, in both type of explants, a reduction in chorophyll contents was observed. For osmotic adjustment, high concentrations of compatible solutes (proline and quaternary ammonium compounds QAC) were accumulated in tissues. The Na+ and Cl- concentrations in the explants increased significantly with the salinity level, but Cl- levels were higher, so we suggest that the important deleterious effects in the in vitro explants of Citrus macrophylla grown at increasing NaCl concentrations were due mainly to toxic effects of saline ions, particularly Cl-, at the cellular level. There is evidence that in vitro nodal segments of Citrus macrophylla respond to salinity in a similar way to the whole plant, so this technique could be used for pre-selection and evaluation of salt tolerance. An efficient system of regeneration via organogenesis is the first step in the successful introduction of genetic variation by mutagenesis or genetic transformation. In the present study, we have evaluated the effect of the composition of culture media, incubation conditions, and explant type and origin, on in vitro organogenesis of two citrus rootstocks, alemow and sour orange, using mature tissues taken from in vitro-proliferated shoots. Explants from two citrus rootstocks showed similar responses on the regeneration medium. Best results were obtained when explants from apical shoots were used and cultured in darkness in DKW basal medium in combination with BA. This regeneration protocol could be integrated in a Citrus rootstocks salinity breeding program.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:TDX_UM/oai:www.tdx.cat:10803/364770 |
| Date | 21 January 2016 |
| Creators | Tallón Vila, Carlos Ignacio |
| Contributors | Pérez Tornero, Olaya, Universidad de Murcia. Departamento de Biología Vegetal |
| Publisher | Universidad de Murcia |
| Source Sets | Universidad de Murcia |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/publishedVersion |
| Format | 90 p., application/pdf |
| Source | TDR (Tesis Doctorales en Red) |
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