A piplartina (PPT) ou piperlongumine é um produto natural da classe dos alcaloides encontrada em espécies da família Pipereaceae. Devido a sua alta potência e seletividade na inibição de diversas linhagens de células tumorais, a PPT têm sido investigada como um potencial candidato à fármaco. Neste contexto, estudos relacionados à sua toxicidade e segurança devem ser realizados, incluindo a determinação do papel das enzimas do Citocromo P450 (CYP450) sobre o metabolismo da PPT. Esta família de enzimas é responsável pela biotransformação de cerca de 75% dos fármacos presentes no mercado. Os estudos pré-clínicos que visam avaliar o metabolismo podem ser realizados empregando modelos in vitro como uma ferramenta para predição de características farmacocinéticas in vivo. Assim, o presente estudo teve como objetivo a avaliação do perfil metabólico da PPT frente as enzimas do CYP450 empregando-se estudos in vitro com microssomas hepáticos humanos (HLM) e a posterior predição de parâmetros farmacocinéticos. Estes estudos incluíram a determinação de parâmetros enzimáticos, estudos de inibição da PPT sobre as principais isoformas do CYP450, elucidação estrutural de metabólitos gerados com a reação de metabolismo e, finalmente, estudos de fenotipagem enzimática. A metodologia geral de estudo de metabolismo in vitro envolveu o uso de técnicas cromatográficas acopladas a diversos detectores/analisadores, tais como arranjo de diodos, espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear. O metabolismo foi avaliado pela medida da taxa de desaparecimento da PPT do meio microssomal. Após validação da metodologia para quantificação da PPT e determinação das condições de velocidade inicial de reação, um perfil sigmoidal foi obtido, indicando o metabolismo da PPT por enzimas contendo múltiplos sítios ativos e/ou catálise por diversas enzimas concomitantemente. Os parâmetros cinéticos calculados foram Vmax = 5,5 ± 0,5 nmol mg proteína-1 min-1, S50 = 127,70 ?mol L-1 e Coeficiente de Hill (h) = 3. O clearance intrínseco obtido foi de 22,68 ?L min -1 mg -1. A fração não ligada às proteínas plasmáticas e microssomais foi de 0,07 e 0,76, respectivamente. O clearance in vivo predito foi de 19,79 mL min -1 kg -1, o clearance hepático de 1,89 mL min -1 kg -1 e extração hepática de 0,09. Dentre quatro isoformas avaliadas, CYP3A, CYP2C9, CYP2D6 e CYP1A2, a PPT demonstrou um potencial em causar interação produto natural-medicamento apenas sobre a CYP1A2. A PPT é um inibidor competitivo dose-dependente da CYP1A2, apresentando um valor de Ki de 1,5 ?mol L-1. A razão [I]/Ki obtida de 9,1 prediz uma interação relevante in vivo. Além disso, a PPT apresentou uma inibição tempo-dependente sobre a CYP1A2 com valores de KI de 8 ?mol L-1 e kinact de 0,014 min-1. A inibição dose-, ii NADPH- e tempo-dependente confirmam uma inibição baseada no mecanismo em que o modo pelo qual a PPT liga-se à enzima é irreversível. Baseado nos dados obtidos pelas análises por espectrometria de massa e ressonância magnética nuclear, quatro metabólitos gerados após metabolismo da PPT com HLM tiveram suas estruturas propostas. Assim, foram caracterizados os metabólitos M1 (produto de uma desmetilação na posição meta do anel 3,4,5-trimetoxicinâmico), M2 (produzido por uma epoxidação entre o C3 e C4 do anel lactâmico), M3 (gerado através de uma oxidação no C5 do anel lactâmico) e, finalmente, M4 (produto de uma reação transdiidrodiol entre C3 e C4). O metabólito M4 é formado tardiamente (após 40 min de reação) e provavelmente é um metabólito secundário produzido a partir de M2 através de uma reação trans-diidrodiol. O estudo de fenotipagem demonstrou que as principais isoformas que contribuem para o metabolismo da PPT são a CYP1A2 (formação de M1) e a CYP3A4 (formação de M2 e M3). O emprego das isoformas recombinantes demonstrou a formação de M4 a partir da catálise por diversas isoformas, CYP2C19, CYP2C8, CYP2D6, CYP2B6 e CYP2E1. Portanto, o perfil metabólico do candidato a agente antitumoral PPT frente às enzimas do CYP450 foi demonstrado neste trabalho, proporcionando aspectos relacionados à segurança e eficácia desta substância. Os dados apresentados certamente servirão como guia em estudos clínicos futuros / Piplartine (PPT) or Piperlongumine is a naturally occurring alkaloid found in species of Pipereaceae family. Due its high potency and selectivity of inhibition of several cancer cell lines, PPT has been investigated as a potential drug candidate. In this context, studies related with toxicity and safety should be performed, including the role of the Cytochrome P450 (CYP450) enzymes in PPT metabolism. This family of enzymes is responsible for the biotransformation of 75% of the drugs in the market. The preclinical studies that aim to evaluate the drug metabolism can be performed by employing in vitro models as a tool for prediction of in vivo pharmacokinetic characteristics. Therefore, the aim of this work was to evaluate the metabolic profile of PPT after metabolism by CYP450 enzymes employing in vitro studies with human liver microsomes (HLM) and the ensuing prediction of pharmacokinetic parameters. These studies embraced the kinetic parameters determination, inhibition ability of PPT over the most important CYP450 isoforms, structural elucidation of the produced metabolites after metabolism reaction and, finally, the enzymatic phenotyping study. The general procedure for in vitro metabolism studies consisted of the use of chromatographic techniques coupled to different detectors/analyzers, such as diode array, mass spectrometry and nuclear magnetic resonance. The metabolism was evaluated measuring the rate of disappearance of the PPT from de microsomal medium. After method validation for PPT quantification and determination of initial velocity conditions, the enzymatic kinetics with a sigmoidal profile indicating a metabolism of PPT by enzymes with multiple active sites and/or metabolism by multiple CYP450 enzymes was observed. The following parameters were calculated: Vmax = 5.5 ± 0.5 nmol/mg protein/min, S50 = 127.7 ?mol/L, and Hill coefficient of 3.0. The intrinsic clearance was 22.68 ?L min -1 mg -1. The unbound fraction of PPT on plasmatic and microsomal proteins was 0.07 and 0.76, respectively. The predicted in vivo clearance was 19.79 mL min -1 kg -1, the hepatic clearance was 1.89 mL min -1 kg -1 and the hepatic extraction was 0.09. Among 4 isoforms evaluated, CYP3A, CYP2C9, CYP2D6 and CYP1A2, a potential natural product-drug interaction for only CYP1A2 isoenzyme by PPT was observed. PPT showed to be a competitive and dosedependent inhibitor of CYP1A2, showing a Ki value of 1.5 ?mol L-1. The ratio [I]/Ki of 9.1 predicts an important in vivo interaction. Furthermore, a time-dependent inhibition of CYP1A2 with a KI of 8 ?mol L-1 and a kinact of 0.014 min-1 by PPT was demonstrated. The dose-, time- and NADPH-dependent inhibition confirms an inhibition based on mechanism through an irreversible bond. Based on results obtained from the mass spectrometry analysis and from the nuclear magnetic resonance analysis, four metabolites were identified and characterized. The metabolites characterized were: M1 (product of a demethylation in the 3,4,5-trimethoxyphenyl portion, M2 (derived from an epoxidation between C3 and C4 on the lactone ring), M3 (product of a simple oxidation on C5 of lactone ring), and finally M4 (derived from a dihydrodiol reaction between C3 and C4). The metabolite M4 is produced later (after 40 min of reaction) and probably is a secondary metabolite produced from M2 through a dihydrodiol reaction. The phenotyping study demonstrated that the main isoforms involved in PPT metabolism are CYP1A2 (production of M1) and CYP3A4 (production of M2 and M3). The recombinant isoforms study demonstrated that several isoforms (CYP2C19, CYP2C8, CYP2D6, CYP2B6 and CYP2E1) catalyze the production of M4. In summary, a wide view about the metabolism of the promising drug candidate PPT by CYP450 enzymes was accomplished. These results, certainly, will be a useful guide for further clinical studies of PPT
| Identifer | oai:union.ndltd.org:usp.br/oai:teses.usp.br:tde-03052017-153134 |
| Date | 21 February 2017 |
| Creators | Moreira, Fernanda de Lima |
| Contributors | Oliveira, Anderson Rodrigo Moraes de |
| Publisher | Biblioteca Digitais de Teses e Dissertações da USP |
| Source Sets | Universidade de São Paulo |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | Tese de Doutorado |
| Format | application/pdf |
| Rights | Liberar o conteúdo para acesso público. |
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