Doctora en Ciencias de la Ingeniería, Mención Química / Los vectores virales son un sistema de transferencia génica muy efectivo. Es por esto su amplio uso para terapia génica. Dentro del desarrollo de una terapia génica un punto muy importante a considerar es la producción y purificación de los vectores virales que transportarán dicha terapia. Su producción y purificación debe ser escalable para lograr su uso en las distintas fases de los ensayos clínicos y su posterior comercialización.
El presente estudio aborda distintas etapas de la producción y purificación de vectores virales adenovirus y adenoasociados, centrándose en su uso para una terapia génica contra el alcoholismo. Se realizó la purificación de los vectores adenovirales rAd5V que contenían la secuencia de ARN antisentido de la enzima ALDH2, y se desarrolló un pre-diseño de la purificación como base para la producción de estos vectores a mayor escala para ensayos pre-clínicos. Se pudo concluir que la columna CIM QA1 tiene rendimientos tan buenos como la columna Q-Sepharose, la que ha sido muy usada para esta aplicación. Sin embargo, la columna CIM QA1 puede usar flujos hasta 10 veces mayores que la columna Q-Sepharose XL, manteniendo su rendimiento. Esto implica en una reducción del tiempo de la purificación en forma considerable. Además, se desarrolló la producción y purificación de un vector alternativo para la terapia contra el alcoholismo, el vector usado fue el vector viral Adenoasociado AAV para sus serotipos 2 y 8. Se realizó la producción de los vectores AAV2 y AAV8 y su purificación se realizó usando la columna monolítica CIM QA-1.Se pudo determinar la capacidad de la columna para cada uno de los serotipos de AAV, con una capacidad de 5,2x108 vg/ml para AAV2 y 1,8x1010vg/ml para AAV8.
También se desarrolló un método simplificado para la producción de vectores AAV. El nuevo método simplificado utiliza una doble transfección en una línea celular recombinante de HEK293F, la que puede ser específica para cada terapia génica. Para este estudio, se desarrolló un prototipo del nuevo método utilizando el gen de la proteína GFP como gen de interés. Se logró desarrollar una línea celular HEK293F recombinante. Se logró producir vectores AAV2 y AAV8 con el nuevo método de doble transfección. Sin embargo, la producción fue 40 y 24 veces menor para AAV2 y AAV8 que el método convencional. A pesar que la visualización con TEM no entregó señales claras de problemas en la cápside, los vectores producidos con el nuevo método no fueron infectivos. Esto puede ser por una mala encapsidación de los vectores virales en el momento de la producción. Además, es necesario optimizar el método de producción con la proporción correcta de los tres elementos esenciales para la producción de AAV (ITR-Gen, Rep/Cap y genes ayudantes).
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UCHILE/oai:repositorio.uchile.cl:2250/143630 |
| Date | January 2016 |
| Creators | Lucero Baeza, Alicia Trinidad |
| Contributors | Asenjo de Leuze, Juan, Andrews Farrow, Bárbara, Caviedes Fernández, Pablo, Salazar Aguirre, Oriana, Gerdtzen Hakim, Ziomara |
| Publisher | Universidad de Chile |
| Source Sets | Universidad de Chile |
| Language | Spanish |
| Detected Language | Spanish |
| Type | Tesis |
| Rights | Attribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Chile, http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/cl/ |
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