Arbetet beskriver en analys av innehållet av membranbundna och periplasmiska c-cytokromer hos perkloratodlade GR-1 och jämförelser med c-cytokrominnehållet hos Ideonella dechloratans och andra kända c-cytokromer, samt med genomet för Dechloromonas aromatica. Den jämförande studien av c-cytokromer gjordes med syftet att undersöka en hypotes om att bakterierna använder olika vägar för elektronöverföring till det periplasmiska enzymet (per)kloratreduktas. Cellmembran från GR-1 renframställdes genom ultracentrifugering och periplasma preparerades fram med hjälp av osmotisk chock. Fraktionerna analyserades sedan med SDS-PAGE och peptider med kovalent bundet hem (c-cytokromer) detekterades med hjälp av en specifik färgreaktion. Även Touchdown PCR med degenererade primrar genomfördes på isolerat DNA från GR-1 i ett försök att finna en gen kodande för ett NapC/NirT-liknande protein. Slutligen kolmonoxidbubblades reducerade membran för att undersöka förekomsten av cbb3-typ oxidas. Separation och infärgning av periplasmiska och membranbundna proteiner från GR-1 resulterade i sju respektive åtta peptidband med molekylvikter mellan 8-60 kDa. Inget som framkommit under arbetet talar emot hypotesen om att GR-1 och D. aromatica skulle använda ett NapC/NirT-liknande protein som elektronöverförare till det periplasmiska (per)kloratreduktaset. PCR-analysen resulterade i en produkt som troligtvis är en sekvens från en gen som kodar för ett NapC/NirT-liknande protein och två, eventuellt tre, kandidater för ett NapC/NirT-liknande protein hittades i membranet hos GR-1. Dessutom framkom att GR-1 troligtvis använder cbb3-typ oxidas som terminalt oxidas vid reduktion av syrgas under mikroaerofila förhållanden. Vad gäller I. dechloratans och hypotesen om att denna bakterie använder ett lösligt cytokrom c för elektronöverföring till sitt kloratreduktas så har inget framkommit under arbetet som talar emot detta. Tre kandidater för lösliga cytokrom c-proteiner hittades. För teorin talar även att de försök som tidigare gjorts med att påvisa genen för ett NapC/NirT-liknande protein hos denna bakterie gett negativt resultat. / This work describes an analysis of membrane-anchored and periplasmic c-type cytochromes of perchlorate grown GR-1, and a comparison with the c-type cytochrome content of Ideonella dechloratans, other known c-type cytochromes and the genome of Dechloromonas aromatica. The aim of the comparison was to investigate a hypothesis that the bacteria use different routes for electron transfer to the periplasmic enzyme (per)chlorate reductase. Cell membrane from GR-1 was prepared through ultracentrifugation and periplasm was prepared through osmotic chock. The fractions were separated by SDS-PAGE and peptides containing covalently bound heme (c-type cytochromes) were detected by a specific staining reaction. In an attempt to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein Touchdown PCR was performed on isolated DNA from GR-1, using degenerate primers. Finally, reduced membranes were treated with carbon monoxide to investigate the presence of cbb3-type oxidase. Separation and detection resulted in seven periplasmic peptides and eight membrane anchored peptides, all with molecular weights in a range of 8-60 kDa. Nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of GR-1 and D. aromatica using a NapC/NirT-like protein as an electron carrier to their periplasmic (per)chlorate reductase. The PCR resulted in a product that most likely is a sequence from a gene coding for a NapC/NirT-like protein and two, maybe three, candidates for a NapC/NirT-like protein were also found in the membrane of GR-1. Analysis also revealed that GR-1 most likely makes use of a cbb3-type oxidase for reduction of oxygen during microaerofilic conditions. Concerning I. dechloratans, nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of this bacterium using a soluble cytochrome c as an electron carrier to its chlorate reductase. Three candidates for a soluble cytochrome c protein were found. The theory is also supported by the negative result from earlier attempts to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein in this bacterium.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:UPSALLA1/oai:DiVA.org:kau-775 |
| Date | January 2007 |
| Creators | Palm, Eva-Lotta |
| Publisher | Karlstads universitet, Fakulteten för teknik- och naturvetenskap |
| Source Sets | DiVA Archive at Upsalla University |
| Language | Swedish |
| Detected Language | Swedish |
| Type | Student thesis, info:eu-repo/semantics/bachelorThesis, text |
| Format | application/pdf |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
Page generated in 0.003 seconds