Syftet med arbetet var att utveckla en metod för att rena fram cytokrom c-Id1 ur periplasma från Ideonella dechloratans. Inledningsvis undersöktes proteinets stabilitet vid låga pH. Flera olika kromatografiska metoder provades under arbetets gång. Till de inledande experimenten användes flow-through fraktioner från rening av annat protein som startmaterial. Senare försök gjordes på periplasma från I. dechloratans. Stabilitetsundersökningen gjordes genom att proteinlösningens spektrum registrerades. Lösningen reducerades sedan med ditionit och ett nytt spektrum registrerades. Ett differensspektrum beräknades och absorbansmaximum vid 550 nm användes som mått på mängden cytokrom c-Id1. Undersökningen visade att proteinet är stabilt vid pH ner till 3.0. Första försöken med respektive kromatografisk metod, förutom gelfiltrering, gick ut på att undersöka om proteinet kunde adsorberas till kolonnen eller inte. När proteinet adsorberats till kolonnen ändrades målet med försöken till att försöka eluera det så rent som möjligt. Den slutliga reningsmetoden innehåller tre kromatografiska steg, varav ett behöver optimeras ytterligare för att ge rent protein. Första steget i reningen är katjonbyteskromatografi. Det andra stegetär hydrofob interaktionskromatografi och det sista steget är anjonbyteskromatografi. Efter reningen fanns små mängder föroreningar kvar. Två oönskade proteiner, båda i liten mängd fanns kvar i provet. För att få proteinet helt rent krävs ytterligare optimering av reningsmetoden. Störst potential till förbättring finns troligen i steget med anjonbytaren. Misstankar om att proteinet lätt dimeriserar eller reagerar på annat vis under lagring har funnits under hela arbetet. Resultat från bland annat gelfiltrering har indikerat att så är fallet. Arbetet har inte gettsvar på om cytokrom c-Id1 förändras med tiden eller inte. Bestämning av totala mängden protein samt mängden cytokrom c-Id1 efter reningen gjordes. Dessa analyser visar att 69 μg protein, varav 36 μg cytokrom c-Id1 återstod efter rening från en odling på fyra liter. Halten cytokrom c-Id1 var alltså 52 %. / The aim of this study was to develop a method to purify cytochrome c-Id1 from periplasmic extract of Ideonella dechloratans. First the stability of the protein at low pH was investigated. Several different chromatographic methods were tested during the study. In the first experiments the starting material was flow through fractions from purification of another protein. Later experiments were performed with periplasmic extract from I. dechloratans. The stability determination was made by recording a spectrum from the protein solution. Proteins were then reduced, by dithionite, and a new spectrum was recorded. A difference spectrum was calculated and the absorbance at 550 nm was used as a measure of the amount of cytochrome c-Id1. The investigation showed that the protein is stable at pH 3.0 and higher. The first experiments with each chromatographic method, except gel filtration, were made in order to see whether the protein could be adsorbed to the column or not. When the protein had been adsorbed to the column the target of the experiments changed. The target was then to elude the protein as pure as possible. The resulting purification method contains three chromatographic steps. One of these needs to be further optimized in order to give pure protein. The first step is cation exchange chromatography. The second step is hydrophobic interaction chromatography and the last step is anion exchange chromatography. After purification with this method, small amounts of contaminants were still present. Two unwanted proteins are present, in small amounts. In order to get the protein completely pure further optimization of the method is required. The biggest optimization potential is probably in the anion exchange chromatography step. During this work there have been some indications that the protein easily dimerizes or reacts in some other way upon storage. Results from for example gel filtration have indicated that so is the case. This work has not given an answer to whether cytochrome c-Id1 changes upon storage or not. The total amount of protein as well as the amount of cytochrome c-Id1 after the purification was determined. The analyses showed that the total amount of protein was 69 μg and the amount of cytochrome c-Id1 was 36 μg from four liters of culture. This means that the cytochrome c-Id1 content afterthe purification was 52 %.

Ideonella dechloratans är en av flera isolerade bakteriestammar med förmågan att använda klorat i sin metabolism i anaerob miljö. Detta kan utnyttjas inom exempelvis pappersindustrin där klorat är en miljöfarlig restprodukt efter klordioxidblekning.    Klorat och perklorat har visat sig ha negativa effekter hos både människor, djur och växter vilket ger ett stort behov av mer forskning på förbättrade reningsmetoder. Kan genregleringen av enzymerna som sköter nedbrytningen av klorat, kloratreduktas och kloritdismutas, förbättras genom att exempelvis fungera även i aerob miljö så skulle reningen förbättras samt kostnader dras ner.    Genom att införa promotorregionerna för kloratreduktas och kloritdismutas i en broad-host-range reporterplasmid, pQlacZ-1, så kan dessa testas i flera olika förhållanden och i olika typer av gramnegativa bakterier.    Genom dubbelklyvning av pQlacZ-1 med BamHI och EcoRI så har PCR produkter av Clrp och Cldp från Ideonella dechloratans kunnat ligeras in för att sedan transformeras in i E. coli, XL-1 Blue.    Gelextraktion har visat sig vara den effektivaste reningsmetoden inför ligering men utförligare screening behöver göras på transformanterna för att säkerställa metodens effektivitet. / Ideonella dechloratans is one of several isolated strains of bacteria with the ability to use chlorate in its metabolism in an anaerobic environment. This can be utilized by, for example, the paper industry where chlorate is an environmentally dangerous pollutant after chlorine dioxine bleaching.     Chlorate and perchlorate have been found to have negative effects in humans, animals and plants which give rise to a need for more research on improved purification methods. If the gene regulation of the enzymes that handle the breakdown of chlorate, chlorate reductase and chlorite dismutase, could be improved to work in an aerobic environment then both the purification and cost efficiency could improve.    By inserting the promoter regions for chlorate reductase and chlorite dismutase in a broad-host-range reporterplasmid, pQlacZ-1, they can be evaluated in several different conditions and different strains of gram-negative bacteria.    Through double cleaving of pQlacZ-1 with BamHI and EcoRI, PCR products of Clrp and Cldp from Ideonella dechloratans have been ligated into E. coli, XL-1 Blue.    Gel extraction was found to be the most efficient method of purification before ligation but further screening needs to be performed on the transformants to ensure the efficiency of the method.

Klorat som avfallsprodukt från pappersindustrin har lett till miljöproblem på grund av klorats toxiska verkan på växter och alger, och har även lett till bekymmer för människohälsan där klorat avfallet har kommit i kontakt med dricksvatten. För att åtgärda detta så har mycket forskning gjorts på bakterier med förmågan att reducera klorat till syrgas och kloridjoner, en anaerob process som vissa naturligt förekommande bakterier kan utföra. Med ökad kunskap om regleringen av denna kloratreducerande process, kan dessa bakterier utgöra en effektiv reningsprocess av pappersbrukens avloppsvatten.  Ideonella dechloratans är en sådan bakterie, den har ett genkluster som kodar för de kloratreducerande enzymerna. Nedströms för dessa finns en arsR-sekvens som tros att koda för en transkriptionsfaktor; och ytterligare information om denna transkriptionsfaktor kan möjligen bidra till förståelse av genuttrycket hos den kloratreducerande funktionen. Syftet med detta arbete är att transformera expressionsceller med förmågan att uttrycka arsR, så framtida försök kan göras för att identifiera potentiella bindningssäten för ArsR-proteinet. arsR-sekvensen amplifierades med primrar specifika för ändarna hos arsR, sekvensen ligerades i en pET-21a(+) vektor från Novagen och transformerades med BL21 (DE3) expressionsceller. Med en IPTG inducering kunde ett stort uttryck av olösligt ArsR observeras. Komplikationer med resultatet och framtida tillvägagångsätt diskuteras. / Chlorate as a waste product from the paper industry has caused environmental problems due its toxic effect on plants and algae and is also a concern for human health where chlorate has contaminated the tap water supplies. To address this issue, a great deal of research has been carried out on naturally occurring bacteria that can anaerobically reduce chlorate to oxygen and chloride ions. With additional knowledge of how this chlorate-reducing process is regulated, these bacteria may one day provide an effective purification process of wastewater from paper mills. Ideonella dechloratans is such a bacterium that has a gene cluster which encodes the chlorate-reducing enzymes. Downstream of this cluster is an arsR-sequence believed to encode a transcription factor, which could aid in the understanding of the gene expression for the chlorate-reducing operon. The goal of this research is to transform expression cells with the ability to express the arsR-sequence so that future trials can be made to identify any potential binding sites for the ArsR-protein. The arsR-sequence was amplified with primers specific to the ends of the arsR-sequence. The sequence was then ligated into a pET-21a(+) vector from Novagen and transformed with BL21 (DE3) expression cells. By IPTG inducing these transformants it was possible to observe a significant expression of insoluble ArsR. Complications with the outcome and future approaches are discussed.

Chlorate and perchlorate pollutions have become a problem in the environment in the last decades. Studies have shown that some bacteria can degrade these substances into unharmful substances such as chloride and molecular oxygen. One of these chlorate degrading bacteria is Ideonella dechloratans that uses chlorate reductase and chlorite dismutase to process chlorate. In the promoter gene sequence of chlorite dismutase there might be regulator sequences such as fumarate and nitrate reductase regulator (FNR) and aerobic respiration control protein (ArcA) that might control the transcription of this enzyme. This promoter sequence was placed in a pBBR1MCS-4-LacZ reporter vector and the possible regulatory sequences were changed through site-directed mutagenesis and tested on activity through beta-galactosidase assays. The changes in the FNR binding sequence gave beta-galactosidase activity that was close to a negative control which might give conclusions that either FNR has an important role or an important part of the promoter was hit. The changes in the ArcA regulator binding sequence did not give such big differences and no certainty can be given if this made important changes to the promoter.

<p>Arbetet beskriver en analys av innehållet av membranbundna och periplasmiska c-cytokromer hos perkloratodlade GR-1 och jämförelser med c-cytokrominnehållet hos Ideonella dechloratans och andra kända c-cytokromer, samt med genomet för Dechloromonas aromatica. Den jämförande studien av c-cytokromer gjordes med syftet att undersöka en hypotes om att bakterierna använder olika vägar för elektronöverföring till det periplasmiska enzymet (per)kloratreduktas. Cellmembran från GR-1 renframställdes genom ultracentrifugering och periplasma preparerades fram med hjälp av osmotisk chock. Fraktionerna analyserades sedan med SDS-PAGE och peptider med kovalent bundet hem (c-cytokromer) detekterades med hjälp av en specifik färgreaktion. Även Touchdown PCR med degenererade primrar genomfördes på isolerat DNA från GR-1 i ett försök att finna en gen kodande för ett NapC/NirT-liknande protein. Slutligen kolmonoxidbubblades reducerade membran för att undersöka förekomsten av cbb3-typ oxidas.</p><p>Separation och infärgning av periplasmiska och membranbundna proteiner från GR-1 resulterade i sju respektive åtta peptidband med molekylvikter mellan 8-60 kDa. Inget som framkommit under arbetet talar emot hypotesen om att GR-1 och D. aromatica skulle använda ett NapC/NirT-liknande protein som elektronöverförare till det periplasmiska (per)kloratreduktaset. PCR-analysen resulterade i en produkt som troligtvis är en sekvens från en gen som kodar för ett NapC/NirT-liknande protein och två, eventuellt tre, kandidater för ett NapC/NirT-liknande protein hittades i membranet hos GR-1. Dessutom framkom att GR-1 troligtvis använder cbb3-typ oxidas som terminalt oxidas vid reduktion av syrgas under mikroaerofila förhållanden.</p><p>Vad gäller I. dechloratans och hypotesen om att denna bakterie använder ett lösligt cytokrom c för elektronöverföring till sitt kloratreduktas så har inget framkommit under arbetet som talar emot detta. Tre kandidater för lösliga cytokrom c-proteiner hittades. För teorin talar även att de försök som tidigare gjorts med att påvisa genen för ett NapC/NirT-liknande protein hos denna bakterie gett negativt resultat.</p> / <p>This work describes an analysis of membrane-anchored and periplasmic c-type cytochromes of perchlorate grown GR-1, and a comparison with the c-type cytochrome content of Ideonella dechloratans, other known c-type cytochromes and the genome of Dechloromonas aromatica. The aim of the comparison was to investigate a hypothesis that the bacteria use different routes for electron transfer to the periplasmic enzyme (per)chlorate reductase. Cell membrane from GR-1 was prepared through ultracentrifugation and periplasm was prepared through osmotic chock. The fractions were separated by SDS-PAGE and peptides containing covalently bound heme (c-type cytochromes) were detected by a specific staining reaction. In an attempt to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein Touchdown PCR was performed on isolated DNA from GR-1, using degenerate primers. Finally, reduced membranes were treated with carbon monoxide to investigate the presence of cbb3-type oxidase.</p><p>Separation and detection resulted in seven periplasmic peptides and eight membrane anchored peptides, all with molecular weights in a range of 8-60 kDa. Nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of GR-1 and D. aromatica using a NapC/NirT-like protein as an electron carrier to their periplasmic (per)chlorate reductase. The PCR resulted in a product that most likely is a sequence from a gene coding for a NapC/NirT-like protein and two, maybe three, candidates for a NapC/NirT-like protein were also found in the membrane of GR-1. Analysis also revealed that GR-1 most likely makes use of a cbb3-type oxidase for reduction of oxygen during microaerofilic conditions.</p><p>Concerning I. dechloratans, nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of this bacterium using a soluble cytochrome c as an electron carrier to its chlorate reductase. Three candidates for a soluble cytochrome c protein were found. The theory is also supported by the negative result from earlier attempts to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein in this bacterium.</p>

Arbetet beskriver en analys av innehållet av membranbundna och periplasmiska c-cytokromer hos perkloratodlade GR-1 och jämförelser med c-cytokrominnehållet hos Ideonella dechloratans och andra kända c-cytokromer, samt med genomet för Dechloromonas aromatica. Den jämförande studien av c-cytokromer gjordes med syftet att undersöka en hypotes om att bakterierna använder olika vägar för elektronöverföring till det periplasmiska enzymet (per)kloratreduktas. Cellmembran från GR-1 renframställdes genom ultracentrifugering och periplasma preparerades fram med hjälp av osmotisk chock. Fraktionerna analyserades sedan med SDS-PAGE och peptider med kovalent bundet hem (c-cytokromer) detekterades med hjälp av en specifik färgreaktion. Även Touchdown PCR med degenererade primrar genomfördes på isolerat DNA från GR-1 i ett försök att finna en gen kodande för ett NapC/NirT-liknande protein. Slutligen kolmonoxidbubblades reducerade membran för att undersöka förekomsten av cbb3-typ oxidas. Separation och infärgning av periplasmiska och membranbundna proteiner från GR-1 resulterade i sju respektive åtta peptidband med molekylvikter mellan 8-60 kDa. Inget som framkommit under arbetet talar emot hypotesen om att GR-1 och D. aromatica skulle använda ett NapC/NirT-liknande protein som elektronöverförare till det periplasmiska (per)kloratreduktaset. PCR-analysen resulterade i en produkt som troligtvis är en sekvens från en gen som kodar för ett NapC/NirT-liknande protein och två, eventuellt tre, kandidater för ett NapC/NirT-liknande protein hittades i membranet hos GR-1. Dessutom framkom att GR-1 troligtvis använder cbb3-typ oxidas som terminalt oxidas vid reduktion av syrgas under mikroaerofila förhållanden. Vad gäller I. dechloratans och hypotesen om att denna bakterie använder ett lösligt cytokrom c för elektronöverföring till sitt kloratreduktas så har inget framkommit under arbetet som talar emot detta. Tre kandidater för lösliga cytokrom c-proteiner hittades. För teorin talar även att de försök som tidigare gjorts med att påvisa genen för ett NapC/NirT-liknande protein hos denna bakterie gett negativt resultat. / This work describes an analysis of membrane-anchored and periplasmic c-type cytochromes of perchlorate grown GR-1, and a comparison with the c-type cytochrome content of Ideonella dechloratans, other known c-type cytochromes and the genome of Dechloromonas aromatica. The aim of the comparison was to investigate a hypothesis that the bacteria use different routes for electron transfer to the periplasmic enzyme (per)chlorate reductase. Cell membrane from GR-1 was prepared through ultracentrifugation and periplasm was prepared through osmotic chock. The fractions were separated by SDS-PAGE and peptides containing covalently bound heme (c-type cytochromes) were detected by a specific staining reaction. In an attempt to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein Touchdown PCR was performed on isolated DNA from GR-1, using degenerate primers. Finally, reduced membranes were treated with carbon monoxide to investigate the presence of cbb3-type oxidase. Separation and detection resulted in seven periplasmic peptides and eight membrane anchored peptides, all with molecular weights in a range of 8-60 kDa. Nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of GR-1 and D. aromatica using a NapC/NirT-like protein as an electron carrier to their periplasmic (per)chlorate reductase. The PCR resulted in a product that most likely is a sequence from a gene coding for a NapC/NirT-like protein and two, maybe three, candidates for a NapC/NirT-like protein were also found in the membrane of GR-1. Analysis also revealed that GR-1 most likely makes use of a cbb3-type oxidase for reduction of oxygen during microaerofilic conditions. Concerning I. dechloratans, nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of this bacterium using a soluble cytochrome c as an electron carrier to its chlorate reductase. Three candidates for a soluble cytochrome c protein were found. The theory is also supported by the negative result from earlier attempts to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein in this bacterium.

The bacterium Ideonella dechloratans is a chlorate dissimilating bacteria that contains two enzymesnecessary for the dissimilation, chlorate reductase and chlorite dismutase. The means to regulate chlorite dismutase has previously been reported. However, the mechanism for chlorate reductase and its operon is still not know. The aim of this study was to develop the understanding of this complex mechanism. In order to investigate the potential important factors three intergenic sections upstream chlorate reductase was amplified. It was then inserted into a promoterless reporter vector that expresses the gene for β-galactosidase when a functioning promoter region is inserted. The activity of an inserted region can be measured using a β-galactosidase assay that hydrolyses a substrate resulting in a chromophore that can be measured using spectrophotometry. The three upstream regions inserted into the promoterless vector showed no increased activity compared to background signal from the backbone plasmid. This indicates that the regulation of the operon is complex. The host Escherichia coli strain RM101 may have been a bad host for the experimental setup or the selected region inserted into the reporter vector did not contain the sequences necessary for transcription and regulation. This work also suggests six potential promoter regions found in the intergenic section along with two possible binding sites for the NnrR transcription factor. / Bakterien Ideonella dechloratans är en kloratnedbrytande bakterie som innehåller två enzymer nödvändiga för nedbrytningen, kloratreduktas och kloritdismutas. Regleringen av kloritdismutas har tidigare rapporterats, dock är mekanismen för kloratreduktas och dess operon fortfarande okänt. Syftet med det här arbetet är att utveckla förståelsen för denna komplexa mekanism. För att undersöka de potentiellt viktiga faktorerna för regleringen amplifierades tre sekvenser uppströms genen för kloratreduktas. De fördes in i en reportervektor som saknar en funktionell promotor uppströms genen β-galaktosidas. Aktiviteten hos införda sekvenser kan mätas vid analys av aktivitet hos β-galaktosidas som hydrolyserar ett substrat vilket ger en produkt som är en kromofor som sedan kan mätas via spektrofotometri. De tre uppströmsregionerna som analyserades visade ingen ökad aktivitet jämfört med bakgrundssignalen från reportervektorn utan promotor. Detta indikerar att regleringen är komplex för kloratreduktas och dess operon. Värdcellen Escherichia coli RM101 kan ha varit en dålig värdstamför experimentuppställningen eller så saknades nödvändiga sekvenser för transkription och reglering i regionerna som infogats i reportervektorn. Det här arbetet föreslår sex möjliga promotorsekvenser som finns uppströms kloratreduktas tillsammans med två möjliga bindningsäten för transkriptionsfaktorn NnrR.

De flesta klorater som finns i naturen kommer från utsläpp av människan i flera storaindustrier. Kloraterna påverkar flera olika levande organismer och det är därför viktigt att tahand om dem efter utsläppen. Flera olika bakterier kan bryta ned klorat till klorid och syre, enav dessa är Ideonella dechloratans. Nedbrytningen sker med de alkaliska enzymernakloratreduktas och kloritdismutas under anaeroba förhållanden. I detta arbete har 2Dgelelektrofores utvecklats för alkaliska proteiner i Ideonella dechloratans i syfte att kunnajämföra proteinuttryck under olika odlingsförhållanden. Därefter har en jämförelse mellanaeroba och anaeroba odlingsförhållanden gjorts samt försök att detektera kloritdismutas.Resultatet har blivit att en metod har tagits fram som ger en hög grad av upplösning pågelerna från 2D-gelelektroforesen. Jämförelserna mellan aeroba och anaerobaodlingsförhållanden har visat att det finns stora skillnader i proteinuttryck mellan de bådaodlingsförhållandena. Fler proteiner syns i området pH 8-10 under anaerobaodlingsförhållanden jämfört med aeroba förhållanden. Försök till identifiering avkloritdismutas har gjorts för de anaeroba odlingsförhållandena, dock krävs det ytterligarearbete innan en säker identifiering kan göras.

In this work, the identification of the promoter for c-cytochromes Cyt c Id-1 in Ideonella dechloratans has been investigated. Additionally, the study examined investigating whether gene expression is affected by the presence and absence of oxygen. This was investigated by amplifying the promoter region of Cyt c Id-1 (389 bp) and then cloning it into a reporter vector lacking a functional promoter for the upstream gene β-galactosidase. The reporter vector was transformed into E. coli RM101 and grown under both aerobic and anaerobic conditions. To examine the gene expression of Cyt c Id-1 the activity of β-galactosidase has been measured in both the aerobic and anaerobic cultures. The result showed that the gene is induced more in an anaerobic environment than in an aerobic environment, by comparing the activity of β-galactosidase under aerobic and anaerobic conditions. / I detta arbete har identifiering av promotorn för c-cytokromer Cyt c Id-1 i Ideonella dechloratans undersökts, samt att undersöka om genuttrycket påverkas av närvaro och frånvaro av syre. Detta är undersökts genom att amplifiera promotorregionen för Cyt c Id-1 (389 bp) för att sedan klona in den in i en reportervektor som saknar en fungerande promotor för uppströms genen β-galaktosidas. Reportervektorn transformerades till E. coli RM101 och odlades under både aeroba och anaeroba förhållanden.  För att undersöka genuttrycket av Cyt c Id-1 har aktiviteten hos β-galaktosidas uppmätts i både de aeroba och anaeroba odlingarna. Resultatet visat att genen induceras mer i anaerob miljö än i aerob miljö, genom att jämföra aktiviteten av β-galaktosidas under både aerob och anaerob förhållande.

Microbial chlorate respiration plays an important role in the turnover of oxochlorates in nature and industrial waste management. This thesis deals with the characterization of the molecular components of chlorate respiration in Ideonella dechloratans. Chlorate respiration utilizes two soluble periplasmic enzymes, chlorate reductase and chlorite dismutase, to convert chlorate to chloride and oxygen. The genes encoding the enzymes participating in the chlorate degradation have been sequenced, and are found in close proximity, forming a gene cluster for chlorate metabolism. This work also includes the successful recombinant expression of three genes from Ideonella dechloratans. Two of the gene products, chlorite dismutase and the C subunit of chlorate reductase, participate in the chlorate respiration. The third gene, which is found close to the gene cluster for chlorate metabolism, encodes a soluble c-type cytochrome. The localization of the gene suggests the corresponding protein as a candidate for a role as electron donor to chlorate reductase. Also, the role of soluble periplasmic c cytochromes of Ideonella dechloratans in chlorate respiration was studied. At least one of the soluble c cytochromes was found capable of serving as electron donor for chlorate reduction. This c cytochrome, and several others, can also donate electrons to a terminal oxidase for subsequent reduction of oxygen, as required for the branched electron flow during chlorate respiration.