Ideonella dechloratans är en av flera isolerade bakteriestammar med förmågan att använda klorat i sin metabolism i anaerob miljö. Detta kan utnyttjas inom exempelvis pappersindustrin där klorat är en miljöfarlig restprodukt efter klordioxidblekning.    Klorat och perklorat har visat sig ha negativa effekter hos både människor, djur och växter vilket ger ett stort behov av mer forskning på förbättrade reningsmetoder. Kan genregleringen av enzymerna som sköter nedbrytningen av klorat, kloratreduktas och kloritdismutas, förbättras genom att exempelvis fungera även i aerob miljö så skulle reningen förbättras samt kostnader dras ner.    Genom att införa promotorregionerna för kloratreduktas och kloritdismutas i en broad-host-range reporterplasmid, pQlacZ-1, så kan dessa testas i flera olika förhållanden och i olika typer av gramnegativa bakterier.    Genom dubbelklyvning av pQlacZ-1 med BamHI och EcoRI så har PCR produkter av Clrp och Cldp från Ideonella dechloratans kunnat ligeras in för att sedan transformeras in i E. coli, XL-1 Blue.    Gelextraktion har visat sig vara den effektivaste reningsmetoden inför ligering men utförligare screening behöver göras på transformanterna för att säkerställa metodens effektivitet. / Ideonella dechloratans is one of several isolated strains of bacteria with the ability to use chlorate in its metabolism in an anaerobic environment. This can be utilized by, for example, the paper industry where chlorate is an environmentally dangerous pollutant after chlorine dioxine bleaching.     Chlorate and perchlorate have been found to have negative effects in humans, animals and plants which give rise to a need for more research on improved purification methods. If the gene regulation of the enzymes that handle the breakdown of chlorate, chlorate reductase and chlorite dismutase, could be improved to work in an aerobic environment then both the purification and cost efficiency could improve.    By inserting the promoter regions for chlorate reductase and chlorite dismutase in a broad-host-range reporterplasmid, pQlacZ-1, they can be evaluated in several different conditions and different strains of gram-negative bacteria.    Through double cleaving of pQlacZ-1 with BamHI and EcoRI, PCR products of Clrp and Cldp from Ideonella dechloratans have been ligated into E. coli, XL-1 Blue.    Gel extraction was found to be the most efficient method of purification before ligation but further screening needs to be performed on the transformants to ensure the efficiency of the method.

<p>Arbetet beskriver en analys av innehållet av membranbundna och periplasmiska c-cytokromer hos perkloratodlade GR-1 och jämförelser med c-cytokrominnehållet hos Ideonella dechloratans och andra kända c-cytokromer, samt med genomet för Dechloromonas aromatica. Den jämförande studien av c-cytokromer gjordes med syftet att undersöka en hypotes om att bakterierna använder olika vägar för elektronöverföring till det periplasmiska enzymet (per)kloratreduktas. Cellmembran från GR-1 renframställdes genom ultracentrifugering och periplasma preparerades fram med hjälp av osmotisk chock. Fraktionerna analyserades sedan med SDS-PAGE och peptider med kovalent bundet hem (c-cytokromer) detekterades med hjälp av en specifik färgreaktion. Även Touchdown PCR med degenererade primrar genomfördes på isolerat DNA från GR-1 i ett försök att finna en gen kodande för ett NapC/NirT-liknande protein. Slutligen kolmonoxidbubblades reducerade membran för att undersöka förekomsten av cbb3-typ oxidas.</p><p>Separation och infärgning av periplasmiska och membranbundna proteiner från GR-1 resulterade i sju respektive åtta peptidband med molekylvikter mellan 8-60 kDa. Inget som framkommit under arbetet talar emot hypotesen om att GR-1 och D. aromatica skulle använda ett NapC/NirT-liknande protein som elektronöverförare till det periplasmiska (per)kloratreduktaset. PCR-analysen resulterade i en produkt som troligtvis är en sekvens från en gen som kodar för ett NapC/NirT-liknande protein och två, eventuellt tre, kandidater för ett NapC/NirT-liknande protein hittades i membranet hos GR-1. Dessutom framkom att GR-1 troligtvis använder cbb3-typ oxidas som terminalt oxidas vid reduktion av syrgas under mikroaerofila förhållanden.</p><p>Vad gäller I. dechloratans och hypotesen om att denna bakterie använder ett lösligt cytokrom c för elektronöverföring till sitt kloratreduktas så har inget framkommit under arbetet som talar emot detta. Tre kandidater för lösliga cytokrom c-proteiner hittades. För teorin talar även att de försök som tidigare gjorts med att påvisa genen för ett NapC/NirT-liknande protein hos denna bakterie gett negativt resultat.</p> / <p>This work describes an analysis of membrane-anchored and periplasmic c-type cytochromes of perchlorate grown GR-1, and a comparison with the c-type cytochrome content of Ideonella dechloratans, other known c-type cytochromes and the genome of Dechloromonas aromatica. The aim of the comparison was to investigate a hypothesis that the bacteria use different routes for electron transfer to the periplasmic enzyme (per)chlorate reductase. Cell membrane from GR-1 was prepared through ultracentrifugation and periplasm was prepared through osmotic chock. The fractions were separated by SDS-PAGE and peptides containing covalently bound heme (c-type cytochromes) were detected by a specific staining reaction. In an attempt to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein Touchdown PCR was performed on isolated DNA from GR-1, using degenerate primers. Finally, reduced membranes were treated with carbon monoxide to investigate the presence of cbb3-type oxidase.</p><p>Separation and detection resulted in seven periplasmic peptides and eight membrane anchored peptides, all with molecular weights in a range of 8-60 kDa. Nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of GR-1 and D. aromatica using a NapC/NirT-like protein as an electron carrier to their periplasmic (per)chlorate reductase. The PCR resulted in a product that most likely is a sequence from a gene coding for a NapC/NirT-like protein and two, maybe three, candidates for a NapC/NirT-like protein were also found in the membrane of GR-1. Analysis also revealed that GR-1 most likely makes use of a cbb3-type oxidase for reduction of oxygen during microaerofilic conditions.</p><p>Concerning I. dechloratans, nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of this bacterium using a soluble cytochrome c as an electron carrier to its chlorate reductase. Three candidates for a soluble cytochrome c protein were found. The theory is also supported by the negative result from earlier attempts to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein in this bacterium.</p>

Arbetet beskriver en analys av innehållet av membranbundna och periplasmiska c-cytokromer hos perkloratodlade GR-1 och jämförelser med c-cytokrominnehållet hos Ideonella dechloratans och andra kända c-cytokromer, samt med genomet för Dechloromonas aromatica. Den jämförande studien av c-cytokromer gjordes med syftet att undersöka en hypotes om att bakterierna använder olika vägar för elektronöverföring till det periplasmiska enzymet (per)kloratreduktas. Cellmembran från GR-1 renframställdes genom ultracentrifugering och periplasma preparerades fram med hjälp av osmotisk chock. Fraktionerna analyserades sedan med SDS-PAGE och peptider med kovalent bundet hem (c-cytokromer) detekterades med hjälp av en specifik färgreaktion. Även Touchdown PCR med degenererade primrar genomfördes på isolerat DNA från GR-1 i ett försök att finna en gen kodande för ett NapC/NirT-liknande protein. Slutligen kolmonoxidbubblades reducerade membran för att undersöka förekomsten av cbb3-typ oxidas. Separation och infärgning av periplasmiska och membranbundna proteiner från GR-1 resulterade i sju respektive åtta peptidband med molekylvikter mellan 8-60 kDa. Inget som framkommit under arbetet talar emot hypotesen om att GR-1 och D. aromatica skulle använda ett NapC/NirT-liknande protein som elektronöverförare till det periplasmiska (per)kloratreduktaset. PCR-analysen resulterade i en produkt som troligtvis är en sekvens från en gen som kodar för ett NapC/NirT-liknande protein och två, eventuellt tre, kandidater för ett NapC/NirT-liknande protein hittades i membranet hos GR-1. Dessutom framkom att GR-1 troligtvis använder cbb3-typ oxidas som terminalt oxidas vid reduktion av syrgas under mikroaerofila förhållanden. Vad gäller I. dechloratans och hypotesen om att denna bakterie använder ett lösligt cytokrom c för elektronöverföring till sitt kloratreduktas så har inget framkommit under arbetet som talar emot detta. Tre kandidater för lösliga cytokrom c-proteiner hittades. För teorin talar även att de försök som tidigare gjorts med att påvisa genen för ett NapC/NirT-liknande protein hos denna bakterie gett negativt resultat. / This work describes an analysis of membrane-anchored and periplasmic c-type cytochromes of perchlorate grown GR-1, and a comparison with the c-type cytochrome content of Ideonella dechloratans, other known c-type cytochromes and the genome of Dechloromonas aromatica. The aim of the comparison was to investigate a hypothesis that the bacteria use different routes for electron transfer to the periplasmic enzyme (per)chlorate reductase. Cell membrane from GR-1 was prepared through ultracentrifugation and periplasm was prepared through osmotic chock. The fractions were separated by SDS-PAGE and peptides containing covalently bound heme (c-type cytochromes) were detected by a specific staining reaction. In an attempt to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein Touchdown PCR was performed on isolated DNA from GR-1, using degenerate primers. Finally, reduced membranes were treated with carbon monoxide to investigate the presence of cbb3-type oxidase. Separation and detection resulted in seven periplasmic peptides and eight membrane anchored peptides, all with molecular weights in a range of 8-60 kDa. Nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of GR-1 and D. aromatica using a NapC/NirT-like protein as an electron carrier to their periplasmic (per)chlorate reductase. The PCR resulted in a product that most likely is a sequence from a gene coding for a NapC/NirT-like protein and two, maybe three, candidates for a NapC/NirT-like protein were also found in the membrane of GR-1. Analysis also revealed that GR-1 most likely makes use of a cbb3-type oxidase for reduction of oxygen during microaerofilic conditions. Concerning I. dechloratans, nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of this bacterium using a soluble cytochrome c as an electron carrier to its chlorate reductase. Three candidates for a soluble cytochrome c protein were found. The theory is also supported by the negative result from earlier attempts to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein in this bacterium.

The bacterium Ideonella dechloratans is a chlorate dissimilating bacteria that contains two enzymesnecessary for the dissimilation, chlorate reductase and chlorite dismutase. The means to regulate chlorite dismutase has previously been reported. However, the mechanism for chlorate reductase and its operon is still not know. The aim of this study was to develop the understanding of this complex mechanism. In order to investigate the potential important factors three intergenic sections upstream chlorate reductase was amplified. It was then inserted into a promoterless reporter vector that expresses the gene for β-galactosidase when a functioning promoter region is inserted. The activity of an inserted region can be measured using a β-galactosidase assay that hydrolyses a substrate resulting in a chromophore that can be measured using spectrophotometry. The three upstream regions inserted into the promoterless vector showed no increased activity compared to background signal from the backbone plasmid. This indicates that the regulation of the operon is complex. The host Escherichia coli strain RM101 may have been a bad host for the experimental setup or the selected region inserted into the reporter vector did not contain the sequences necessary for transcription and regulation. This work also suggests six potential promoter regions found in the intergenic section along with two possible binding sites for the NnrR transcription factor. / Bakterien Ideonella dechloratans är en kloratnedbrytande bakterie som innehåller två enzymer nödvändiga för nedbrytningen, kloratreduktas och kloritdismutas. Regleringen av kloritdismutas har tidigare rapporterats, dock är mekanismen för kloratreduktas och dess operon fortfarande okänt. Syftet med det här arbetet är att utveckla förståelsen för denna komplexa mekanism. För att undersöka de potentiellt viktiga faktorerna för regleringen amplifierades tre sekvenser uppströms genen för kloratreduktas. De fördes in i en reportervektor som saknar en funktionell promotor uppströms genen β-galaktosidas. Aktiviteten hos införda sekvenser kan mätas vid analys av aktivitet hos β-galaktosidas som hydrolyserar ett substrat vilket ger en produkt som är en kromofor som sedan kan mätas via spektrofotometri. De tre uppströmsregionerna som analyserades visade ingen ökad aktivitet jämfört med bakgrundssignalen från reportervektorn utan promotor. Detta indikerar att regleringen är komplex för kloratreduktas och dess operon. Värdcellen Escherichia coli RM101 kan ha varit en dålig värdstamför experimentuppställningen eller så saknades nödvändiga sekvenser för transkription och reglering i regionerna som infogats i reportervektorn. Det här arbetet föreslår sex möjliga promotorsekvenser som finns uppströms kloratreduktas tillsammans med två möjliga bindningsäten för transkriptionsfaktorn NnrR.

In this work, the identification of the promoter for c-cytochromes Cyt c Id-1 in Ideonella dechloratans has been investigated. Additionally, the study examined investigating whether gene expression is affected by the presence and absence of oxygen. This was investigated by amplifying the promoter region of Cyt c Id-1 (389 bp) and then cloning it into a reporter vector lacking a functional promoter for the upstream gene β-galactosidase. The reporter vector was transformed into E. coli RM101 and grown under both aerobic and anaerobic conditions. To examine the gene expression of Cyt c Id-1 the activity of β-galactosidase has been measured in both the aerobic and anaerobic cultures. The result showed that the gene is induced more in an anaerobic environment than in an aerobic environment, by comparing the activity of β-galactosidase under aerobic and anaerobic conditions. / I detta arbete har identifiering av promotorn för c-cytokromer Cyt c Id-1 i Ideonella dechloratans undersökts, samt att undersöka om genuttrycket påverkas av närvaro och frånvaro av syre. Detta är undersökts genom att amplifiera promotorregionen för Cyt c Id-1 (389 bp) för att sedan klona in den in i en reportervektor som saknar en fungerande promotor för uppströms genen β-galaktosidas. Reportervektorn transformerades till E. coli RM101 och odlades under både aeroba och anaeroba förhållanden.  För att undersöka genuttrycket av Cyt c Id-1 har aktiviteten hos β-galaktosidas uppmätts i både de aeroba och anaeroba odlingarna. Resultatet visat att genen induceras mer i anaerob miljö än i aerob miljö, genom att jämföra aktiviteten av β-galaktosidas under både aerob och anaerob förhållande.