Contamination of perchlorate and chlorate in nature is primarily the result of various industrial processes. The microbial respiration of these oxyanions of chlorine plays a major role in reducing the society’s impact on the environment. The focus with this thesis is to investigate the oxygen-dependent regulation of key components involved in the chlorate respiration in the gram‑negative bacterium Ideonella dechloratans. Chlorate metabolism is based on the action of the enzymes chlorate reductase and chlorite dismutase and results in the end products molecular oxygen and chloride ion. Up‑regulation of chlorite dismutase activity in the absence of oxygen is demonstrated to occur at the transcriptional level, with the participation of the transcriptional fumarate and nitrate reduction regulator (FNR). Also, the chlorate reductase enzyme was shown to be regulated at the transcriptional level with the possible involvement of additional regulating mechanisms as well. Interestingly, the corresponding chlorate reductase operon was found to be part of a polycistronic mRNA which also comprises the gene for a cytochrome c and a putative transcriptional regulator protein.

Microbial chlorate respiration plays an important role in the turnover of oxochlorates in nature and industrial waste management. This thesis deals with the characterization of the molecular components of chlorate respiration in Ideonella dechloratans. Chlorate respiration utilizes two soluble periplasmic enzymes, chlorate reductase and chlorite dismutase, to convert chlorate to chloride and oxygen. The genes encoding the enzymes participating in the chlorate degradation have been sequenced, and are found in close proximity, forming a gene cluster for chlorate metabolism. This work also includes the successful recombinant expression of three genes from Ideonella dechloratans. Two of the gene products, chlorite dismutase and the C subunit of chlorate reductase, participate in the chlorate respiration. The third gene, which is found close to the gene cluster for chlorate metabolism, encodes a soluble c-type cytochrome. The localization of the gene suggests the corresponding protein as a candidate for a role as electron donor to chlorate reductase. Also, the role of soluble periplasmic c cytochromes of Ideonella dechloratans in chlorate respiration was studied. At least one of the soluble c cytochromes was found capable of serving as electron donor for chlorate reduction. This c cytochrome, and several others, can also donate electrons to a terminal oxidase for subsequent reduction of oxygen, as required for the branched electron flow during chlorate respiration.

<p>Arbetet beskriver en analys av innehållet av membranbundna och periplasmiska c-cytokromer hos perkloratodlade GR-1 och jämförelser med c-cytokrominnehållet hos Ideonella dechloratans och andra kända c-cytokromer, samt med genomet för Dechloromonas aromatica. Den jämförande studien av c-cytokromer gjordes med syftet att undersöka en hypotes om att bakterierna använder olika vägar för elektronöverföring till det periplasmiska enzymet (per)kloratreduktas. Cellmembran från GR-1 renframställdes genom ultracentrifugering och periplasma preparerades fram med hjälp av osmotisk chock. Fraktionerna analyserades sedan med SDS-PAGE och peptider med kovalent bundet hem (c-cytokromer) detekterades med hjälp av en specifik färgreaktion. Även Touchdown PCR med degenererade primrar genomfördes på isolerat DNA från GR-1 i ett försök att finna en gen kodande för ett NapC/NirT-liknande protein. Slutligen kolmonoxidbubblades reducerade membran för att undersöka förekomsten av cbb3-typ oxidas.</p><p>Separation och infärgning av periplasmiska och membranbundna proteiner från GR-1 resulterade i sju respektive åtta peptidband med molekylvikter mellan 8-60 kDa. Inget som framkommit under arbetet talar emot hypotesen om att GR-1 och D. aromatica skulle använda ett NapC/NirT-liknande protein som elektronöverförare till det periplasmiska (per)kloratreduktaset. PCR-analysen resulterade i en produkt som troligtvis är en sekvens från en gen som kodar för ett NapC/NirT-liknande protein och två, eventuellt tre, kandidater för ett NapC/NirT-liknande protein hittades i membranet hos GR-1. Dessutom framkom att GR-1 troligtvis använder cbb3-typ oxidas som terminalt oxidas vid reduktion av syrgas under mikroaerofila förhållanden.</p><p>Vad gäller I. dechloratans och hypotesen om att denna bakterie använder ett lösligt cytokrom c för elektronöverföring till sitt kloratreduktas så har inget framkommit under arbetet som talar emot detta. Tre kandidater för lösliga cytokrom c-proteiner hittades. För teorin talar även att de försök som tidigare gjorts med att påvisa genen för ett NapC/NirT-liknande protein hos denna bakterie gett negativt resultat.</p> / <p>This work describes an analysis of membrane-anchored and periplasmic c-type cytochromes of perchlorate grown GR-1, and a comparison with the c-type cytochrome content of Ideonella dechloratans, other known c-type cytochromes and the genome of Dechloromonas aromatica. The aim of the comparison was to investigate a hypothesis that the bacteria use different routes for electron transfer to the periplasmic enzyme (per)chlorate reductase. Cell membrane from GR-1 was prepared through ultracentrifugation and periplasm was prepared through osmotic chock. The fractions were separated by SDS-PAGE and peptides containing covalently bound heme (c-type cytochromes) were detected by a specific staining reaction. In an attempt to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein Touchdown PCR was performed on isolated DNA from GR-1, using degenerate primers. Finally, reduced membranes were treated with carbon monoxide to investigate the presence of cbb3-type oxidase.</p><p>Separation and detection resulted in seven periplasmic peptides and eight membrane anchored peptides, all with molecular weights in a range of 8-60 kDa. Nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of GR-1 and D. aromatica using a NapC/NirT-like protein as an electron carrier to their periplasmic (per)chlorate reductase. The PCR resulted in a product that most likely is a sequence from a gene coding for a NapC/NirT-like protein and two, maybe three, candidates for a NapC/NirT-like protein were also found in the membrane of GR-1. Analysis also revealed that GR-1 most likely makes use of a cbb3-type oxidase for reduction of oxygen during microaerofilic conditions.</p><p>Concerning I. dechloratans, nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of this bacterium using a soluble cytochrome c as an electron carrier to its chlorate reductase. Three candidates for a soluble cytochrome c protein were found. The theory is also supported by the negative result from earlier attempts to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein in this bacterium.</p>

Arbetet beskriver en analys av innehållet av membranbundna och periplasmiska c-cytokromer hos perkloratodlade GR-1 och jämförelser med c-cytokrominnehållet hos Ideonella dechloratans och andra kända c-cytokromer, samt med genomet för Dechloromonas aromatica. Den jämförande studien av c-cytokromer gjordes med syftet att undersöka en hypotes om att bakterierna använder olika vägar för elektronöverföring till det periplasmiska enzymet (per)kloratreduktas. Cellmembran från GR-1 renframställdes genom ultracentrifugering och periplasma preparerades fram med hjälp av osmotisk chock. Fraktionerna analyserades sedan med SDS-PAGE och peptider med kovalent bundet hem (c-cytokromer) detekterades med hjälp av en specifik färgreaktion. Även Touchdown PCR med degenererade primrar genomfördes på isolerat DNA från GR-1 i ett försök att finna en gen kodande för ett NapC/NirT-liknande protein. Slutligen kolmonoxidbubblades reducerade membran för att undersöka förekomsten av cbb3-typ oxidas. Separation och infärgning av periplasmiska och membranbundna proteiner från GR-1 resulterade i sju respektive åtta peptidband med molekylvikter mellan 8-60 kDa. Inget som framkommit under arbetet talar emot hypotesen om att GR-1 och D. aromatica skulle använda ett NapC/NirT-liknande protein som elektronöverförare till det periplasmiska (per)kloratreduktaset. PCR-analysen resulterade i en produkt som troligtvis är en sekvens från en gen som kodar för ett NapC/NirT-liknande protein och två, eventuellt tre, kandidater för ett NapC/NirT-liknande protein hittades i membranet hos GR-1. Dessutom framkom att GR-1 troligtvis använder cbb3-typ oxidas som terminalt oxidas vid reduktion av syrgas under mikroaerofila förhållanden. Vad gäller I. dechloratans och hypotesen om att denna bakterie använder ett lösligt cytokrom c för elektronöverföring till sitt kloratreduktas så har inget framkommit under arbetet som talar emot detta. Tre kandidater för lösliga cytokrom c-proteiner hittades. För teorin talar även att de försök som tidigare gjorts med att påvisa genen för ett NapC/NirT-liknande protein hos denna bakterie gett negativt resultat. / This work describes an analysis of membrane-anchored and periplasmic c-type cytochromes of perchlorate grown GR-1, and a comparison with the c-type cytochrome content of Ideonella dechloratans, other known c-type cytochromes and the genome of Dechloromonas aromatica. The aim of the comparison was to investigate a hypothesis that the bacteria use different routes for electron transfer to the periplasmic enzyme (per)chlorate reductase. Cell membrane from GR-1 was prepared through ultracentrifugation and periplasm was prepared through osmotic chock. The fractions were separated by SDS-PAGE and peptides containing covalently bound heme (c-type cytochromes) were detected by a specific staining reaction. In an attempt to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein Touchdown PCR was performed on isolated DNA from GR-1, using degenerate primers. Finally, reduced membranes were treated with carbon monoxide to investigate the presence of cbb3-type oxidase. Separation and detection resulted in seven periplasmic peptides and eight membrane anchored peptides, all with molecular weights in a range of 8-60 kDa. Nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of GR-1 and D. aromatica using a NapC/NirT-like protein as an electron carrier to their periplasmic (per)chlorate reductase. The PCR resulted in a product that most likely is a sequence from a gene coding for a NapC/NirT-like protein and two, maybe three, candidates for a NapC/NirT-like protein were also found in the membrane of GR-1. Analysis also revealed that GR-1 most likely makes use of a cbb3-type oxidase for reduction of oxygen during microaerofilic conditions. Concerning I. dechloratans, nothing has been revealed during this work that opposes the hypothesis of this bacterium using a soluble cytochrome c as an electron carrier to its chlorate reductase. Three candidates for a soluble cytochrome c protein were found. The theory is also supported by the negative result from earlier attempts to probe a gene coding for a NapC/NirT-like protein in this bacterium.

The bacterium Ideonella dechloratans is a chlorate dissimilating bacteria that contains two enzymesnecessary for the dissimilation, chlorate reductase and chlorite dismutase. The means to regulate chlorite dismutase has previously been reported. However, the mechanism for chlorate reductase and its operon is still not know. The aim of this study was to develop the understanding of this complex mechanism. In order to investigate the potential important factors three intergenic sections upstream chlorate reductase was amplified. It was then inserted into a promoterless reporter vector that expresses the gene for β-galactosidase when a functioning promoter region is inserted. The activity of an inserted region can be measured using a β-galactosidase assay that hydrolyses a substrate resulting in a chromophore that can be measured using spectrophotometry. The three upstream regions inserted into the promoterless vector showed no increased activity compared to background signal from the backbone plasmid. This indicates that the regulation of the operon is complex. The host Escherichia coli strain RM101 may have been a bad host for the experimental setup or the selected region inserted into the reporter vector did not contain the sequences necessary for transcription and regulation. This work also suggests six potential promoter regions found in the intergenic section along with two possible binding sites for the NnrR transcription factor. / Bakterien Ideonella dechloratans är en kloratnedbrytande bakterie som innehåller två enzymer nödvändiga för nedbrytningen, kloratreduktas och kloritdismutas. Regleringen av kloritdismutas har tidigare rapporterats, dock är mekanismen för kloratreduktas och dess operon fortfarande okänt. Syftet med det här arbetet är att utveckla förståelsen för denna komplexa mekanism. För att undersöka de potentiellt viktiga faktorerna för regleringen amplifierades tre sekvenser uppströms genen för kloratreduktas. De fördes in i en reportervektor som saknar en funktionell promotor uppströms genen β-galaktosidas. Aktiviteten hos införda sekvenser kan mätas vid analys av aktivitet hos β-galaktosidas som hydrolyserar ett substrat vilket ger en produkt som är en kromofor som sedan kan mätas via spektrofotometri. De tre uppströmsregionerna som analyserades visade ingen ökad aktivitet jämfört med bakgrundssignalen från reportervektorn utan promotor. Detta indikerar att regleringen är komplex för kloratreduktas och dess operon. Värdcellen Escherichia coli RM101 kan ha varit en dålig värdstamför experimentuppställningen eller så saknades nödvändiga sekvenser för transkription och reglering i regionerna som infogats i reportervektorn. Det här arbetet föreslår sex möjliga promotorsekvenser som finns uppströms kloratreduktas tillsammans med två möjliga bindningsäten för transkriptionsfaktorn NnrR.

In this work, the identification of the promoter for c-cytochromes Cyt c Id-1 in Ideonella dechloratans has been investigated. Additionally, the study examined investigating whether gene expression is affected by the presence and absence of oxygen. This was investigated by amplifying the promoter region of Cyt c Id-1 (389 bp) and then cloning it into a reporter vector lacking a functional promoter for the upstream gene β-galactosidase. The reporter vector was transformed into E. coli RM101 and grown under both aerobic and anaerobic conditions. To examine the gene expression of Cyt c Id-1 the activity of β-galactosidase has been measured in both the aerobic and anaerobic cultures. The result showed that the gene is induced more in an anaerobic environment than in an aerobic environment, by comparing the activity of β-galactosidase under aerobic and anaerobic conditions. / I detta arbete har identifiering av promotorn för c-cytokromer Cyt c Id-1 i Ideonella dechloratans undersökts, samt att undersöka om genuttrycket påverkas av närvaro och frånvaro av syre. Detta är undersökts genom att amplifiera promotorregionen för Cyt c Id-1 (389 bp) för att sedan klona in den in i en reportervektor som saknar en fungerande promotor för uppströms genen β-galaktosidas. Reportervektorn transformerades till E. coli RM101 och odlades under både aeroba och anaeroba förhållanden.  För att undersöka genuttrycket av Cyt c Id-1 har aktiviteten hos β-galaktosidas uppmätts i både de aeroba och anaeroba odlingarna. Resultatet visat att genen induceras mer i anaerob miljö än i aerob miljö, genom att jämföra aktiviteten av β-galaktosidas under både aerob och anaerob förhållande.