Syftet med detta projekt var att konstruera en mindre variant av pQlacZ-1 för att senare kunna använda den som reportervektor i Ideonella dechloratans. pQlacZ-1 är en plasmid som är 17,1 kbp stor, som skulle kunna användas som reportervektor i  Ideonella dechloratans för att kunna undersöka olika promotorsekvenser. Detta är möjligt eftersom pQlacZ-1 är en broad host range plasmid och saknar promotorsekvensen för lacZ genen. Ett problem med pQlacZ-1 är dess storlek vilket gör den svår att transformera, och då speciellt i Ideonella dechloratans som är svår att transformera överhuvudtaget. En stor del av projektet har lagts på att ta reda på hur pQlacZ-1 ser ut i detalj, då detta inte finns väl beskrivet. Även efter denna studie saknas information om ett fragment för att få en helt klar bild över hur plasmiden är uppbyggd. Efter att ha ställt upp en hypotes om hur plasmiden ser ut så identifierades ett område som kunde klyvas bort och det var fragmentet med lacA och lacY. Detta gjordes  genom en dubbelklyvning med SalI och BstBI. Den nya mindre varianten av plasmiden har jag valt att kalla pQlacZ-1cc och den ska teoretiskt sett vara ca 13427 bp stor, vilket bör göra den lättare att jobba med. Ytterligare arbete behövs för att verifiera konstruktionen i pQlacZ-1cc. / The aim with this project was to design a smaller version of pQlacZ-1 in order to later use it as a reporter vector in Ideonella dechloratans.  pQlacZ-1 is a plasmid that is 17,1 kbp big, which might be used as a reporter vector in Ideonella dechloratans to investigate different promoter sequences. This is possible because pQlacZ-1 is a broad host range plasmid and lacks the promoter sequence of the lacZ gene. A problem with pQlacZ-1 is its size which makes it difficult to transform, and especially in Ideonella dechloratans which is difficult to transform at all. A large part of the project has been about finding out how pQlacZ-1 looks like in detail, as this is not well described. Even after this study information about one fragment is missing to get a completely clear picture of how the plasmid is constructed. After formulation of a hypothesis about how the plasmid is constructed, a section that could be removed was identified. The part of pQlacZ-1 that was removed was the lacA and lacY. This was done by a double digestion with SalI and BstBI. The new smaller version of the plasmid, is called pQlacZ-1cc. Theoretically it should be about 13427 bp, which should make it easier to work with. Additional work is required to verify the design of pQlacZ-1cc.

Ideonella dechloratans är en av flera isolerade bakteriestammar med förmågan att använda klorat i sin metabolism i anaerob miljö. Detta kan utnyttjas inom exempelvis pappersindustrin där klorat är en miljöfarlig restprodukt efter klordioxidblekning.    Klorat och perklorat har visat sig ha negativa effekter hos både människor, djur och växter vilket ger ett stort behov av mer forskning på förbättrade reningsmetoder. Kan genregleringen av enzymerna som sköter nedbrytningen av klorat, kloratreduktas och kloritdismutas, förbättras genom att exempelvis fungera även i aerob miljö så skulle reningen förbättras samt kostnader dras ner.    Genom att införa promotorregionerna för kloratreduktas och kloritdismutas i en broad-host-range reporterplasmid, pQlacZ-1, så kan dessa testas i flera olika förhållanden och i olika typer av gramnegativa bakterier.    Genom dubbelklyvning av pQlacZ-1 med BamHI och EcoRI så har PCR produkter av Clrp och Cldp från Ideonella dechloratans kunnat ligeras in för att sedan transformeras in i E. coli, XL-1 Blue.    Gelextraktion har visat sig vara den effektivaste reningsmetoden inför ligering men utförligare screening behöver göras på transformanterna för att säkerställa metodens effektivitet. / Ideonella dechloratans is one of several isolated strains of bacteria with the ability to use chlorate in its metabolism in an anaerobic environment. This can be utilized by, for example, the paper industry where chlorate is an environmentally dangerous pollutant after chlorine dioxine bleaching.     Chlorate and perchlorate have been found to have negative effects in humans, animals and plants which give rise to a need for more research on improved purification methods. If the gene regulation of the enzymes that handle the breakdown of chlorate, chlorate reductase and chlorite dismutase, could be improved to work in an aerobic environment then both the purification and cost efficiency could improve.    By inserting the promoter regions for chlorate reductase and chlorite dismutase in a broad-host-range reporterplasmid, pQlacZ-1, they can be evaluated in several different conditions and different strains of gram-negative bacteria.    Through double cleaving of pQlacZ-1 with BamHI and EcoRI, PCR products of Clrp and Cldp from Ideonella dechloratans have been ligated into E. coli, XL-1 Blue.    Gel extraction was found to be the most efficient method of purification before ligation but further screening needs to be performed on the transformants to ensure the efficiency of the method.