Syftet med arbetet var att utveckla en metod för att rena fram cytokrom c-Id1 ur periplasma från Ideonella dechloratans. Inledningsvis undersöktes proteinets stabilitet vid låga pH. Flera olika kromatografiska metoder provades under arbetets gång. Till de inledande experimenten användes flow-through fraktioner från rening av annat protein som startmaterial. Senare försök gjordes på periplasma från I. dechloratans. Stabilitetsundersökningen gjordes genom att proteinlösningens spektrum registrerades. Lösningen reducerades sedan med ditionit och ett nytt spektrum registrerades. Ett differensspektrum beräknades och absorbansmaximum vid 550 nm användes som mått på mängden cytokrom c-Id1. Undersökningen visade att proteinet är stabilt vid pH ner till 3.0. Första försöken med respektive kromatografisk metod, förutom gelfiltrering, gick ut på att undersöka om proteinet kunde adsorberas till kolonnen eller inte. När proteinet adsorberats till kolonnen ändrades målet med försöken till att försöka eluera det så rent som möjligt. Den slutliga reningsmetoden innehåller tre kromatografiska steg, varav ett behöver optimeras ytterligare för att ge rent protein. Första steget i reningen är katjonbyteskromatografi. Det andra stegetär hydrofob interaktionskromatografi och det sista steget är anjonbyteskromatografi. Efter reningen fanns små mängder föroreningar kvar. Två oönskade proteiner, båda i liten mängd fanns kvar i provet. För att få proteinet helt rent krävs ytterligare optimering av reningsmetoden. Störst potential till förbättring finns troligen i steget med anjonbytaren. Misstankar om att proteinet lätt dimeriserar eller reagerar på annat vis under lagring har funnits under hela arbetet. Resultat från bland annat gelfiltrering har indikerat att så är fallet. Arbetet har inte gettsvar på om cytokrom c-Id1 förändras med tiden eller inte. Bestämning av totala mängden protein samt mängden cytokrom c-Id1 efter reningen gjordes. Dessa analyser visar att 69 μg protein, varav 36 μg cytokrom c-Id1 återstod efter rening från en odling på fyra liter. Halten cytokrom c-Id1 var alltså 52 %. / The aim of this study was to develop a method to purify cytochrome c-Id1 from periplasmic extract of Ideonella dechloratans. First the stability of the protein at low pH was investigated. Several different chromatographic methods were tested during the study. In the first experiments the starting material was flow through fractions from purification of another protein. Later experiments were performed with periplasmic extract from I. dechloratans. The stability determination was made by recording a spectrum from the protein solution. Proteins were then reduced, by dithionite, and a new spectrum was recorded. A difference spectrum was calculated and the absorbance at 550 nm was used as a measure of the amount of cytochrome c-Id1. The investigation showed that the protein is stable at pH 3.0 and higher. The first experiments with each chromatographic method, except gel filtration, were made in order to see whether the protein could be adsorbed to the column or not. When the protein had been adsorbed to the column the target of the experiments changed. The target was then to elude the protein as pure as possible. The resulting purification method contains three chromatographic steps. One of these needs to be further optimized in order to give pure protein. The first step is cation exchange chromatography. The second step is hydrophobic interaction chromatography and the last step is anion exchange chromatography. After purification with this method, small amounts of contaminants were still present. Two unwanted proteins are present, in small amounts. In order to get the protein completely pure further optimization of the method is required. The biggest optimization potential is probably in the anion exchange chromatography step. During this work there have been some indications that the protein easily dimerizes or reacts in some other way upon storage. Results from for example gel filtration have indicated that so is the case. This work has not given an answer to whether cytochrome c-Id1 changes upon storage or not. The total amount of protein as well as the amount of cytochrome c-Id1 after the purification was determined. The analyses showed that the total amount of protein was 69 μg and the amount of cytochrome c-Id1 was 36 μg from four liters of culture. This means that the cytochrome c-Id1 content afterthe purification was 52 %.

TRIM21 is a cytosolic ubiquitin ligase and an antibody receptor that providesa last line of defense against invading pathogens. By utilizing the diversity ofantibody repertoire to identify pathogens, TRIM21 serves as a link betweenintrinsic cellular defense and adaptive immunity. A variety of diseases havebeen linked to mutations of the TRIM family, including cancer, inflammatorydiseases, and autoimmune diseases. In this project, TRIM21 was producedand purified from Escherichia coli, (E.coli). Protein characterization wasperformed with SDS-PAGE, size exclusion chromatography and cryo-electronmicroscopy (cryo-EM). Previously TRIM21 has been shown to form a dimerwhen produced in SF9. Results from size exclusion chromatography show thatTRIM21 form a larger complex when expressed in E.coli. Cryo-EM resultsshow that the complex structure is more globular than previously thought.Purified TRIM21 was bound to the antibody IC100. SDS-PAGE and sizeexclusion chromatography results show much lower affinity to antibodies thanexpected. / TRIM21 är en cytosolisk ubiquitinligas- och antikroppsreceptor som ger ensista försvarslinje mot invaderande virus. Genom att använda mångfalden avantikroppsrepertoar för att identifiera patogener, fungerar TRIM21 som enlänk mellan inre cellulärt försvar och adaptiv immunitet. En mängd olikasjukdomar har kopplats till mutationer i TRIM-familjen, inklusive cancer,inflammatoriska sjukdomar och autoimmuna sjukdomar. I detta projekt produceradesoch renades TRIM21 från Escherichia coli, (E.coli). Proteinkarakteriseringutfördes med SDS-PAGE, gelfiltreringskromatografi och kryo-elektronmikroskopi(cryo-EM). Tidigare har TRIM21 visat sig bilda en dimer när den producerasi SF9. Resultat från gelfiltrering visar att TRIM21 bildar ett större komplexnär det uttrycks i E.coli. Cryo-EM-resultat visar att den komplexa strukturenär mer klotformig än man tidigare trott. Renad TRIM21 bands till antikroppenIC100. SDS-PAGE och gel-filtrerings resultat visar mycket lägre affinitet tillantikroppar än förväntat.

Pentameriska ligandstyrda jonkanaler (pLGICs) är avgörande för omvandlingen av kemisk till elektrisk signalöverföring i djurs nervsystem. Dysfunktion i dessa kanaler har visat sig vara kopplad till flera sjukdomar inklusive epilepsi, schizofreni, Alzheimers och autism, vilket gör dem till en måltavla för en mängd olika läkemedel. Att studera eukaryota kanaler är dock mycket utmanande, så upptäckten av prokaryota homologer, som är mycket lättare att studera, har därmed bidragit mycket till förståelsen för struktur och funktion hos proteiner i denna familj. I detta projekt producerades och renades en prokaryotisk pLGIC kallad DeCLIC från Escherichia coli. Strukturell bestämning av kanalen genomfördes med användning av kryo-elektronmikroskopi vid lågt pH och i närvaro av kalcium. En elektrontäthet med 3.4 Å upplösning uppnåddes och jämfördes med tidigare bestämda strukturer vid olika förhållanden i ett försök att bestämma hur proteinets struktur moduleras av kalcium och pH. Resultaten visar flera skillnader i kanalens konformation i närvaro och frånvaro av kalcium såväl som vid olika pH-värden. Dessutom antyder analys av den bestämda elektrontätheten ett möjligt intermediärt tillstånd vid lågt pH i närvaro av kalcium. / Pentameric ligand-gated ion channels (pLGICs) are crucial for the conversion of chemical to electrical signaling in the nervous system of mammals. Dysfunction in these channels has been found to be connected to several diseases including epilepsy, schizophrenia, Alzheimer’s, and autism, making them the target of a wide variety of therapeutic agents. However, studying eukaryotic channels is challenging so the discovery of prokaryotic homologs that are much easier to study has thus greatly helped in the understanding of the structure and function in this family of proteins. In this project, a prokaryotic pLGIC called DeCLIC was produced and purified from Escherichia coli. Structural determination of the channel was pursued using cryo-electron microscopy at a low pH and in the presence of calcium. An electron density at 3.4 Å resolution was achieved and compared to previously determined structures at different conditions in an attempt to determine the structural modulation of calcium and pH. Results show multiple differences in channel conformation in the presence and absence of calcium as well as in different pH conditions. Furthermore, analysis of the determined electron density suggests a possible intermediate state at low pH in the presence of calcium.

Ubiquitinbindande protein 2-liknande (UBAP2L) och Ras GTPas-aktiverande proteinsbindande protein 1 (G3BP1) är två kärn-RNA-bindande proteiner (RBPs) som är involverade i bildandet av SGs. Nyligen genomförda studier föreslog att UBAP2L kan fungera som ett upströmsprotein till G3BP1/2 med förmågan att främja SG-bildning oberoende. NTF2-domänen dimeriserar G3BP1 och bildar en plattform för protein-protein-interaktioner. Dess interaktion med UBAP2L-DUF-regionen var avgörande för bildandet av mogna SG. Detta projekt syftade till att avslöja protein-protein-interaktionen mellan G3BP1 och UBAP2L in vitro och karakterisera den kända interaktionen mellan G3BP1-NTF2 och UBAP2L-DUF-regionen. I detta projekt renades homodimeren av G3BP1-NTF2-domänen och komplexades med en syntetiserad peptid som motsvarar rester 505–534 av UBAP2L (UBAP2L 505-534). Låga diffraktionskristallträffar erhölls genom att co-kristallisera G3BP1-NTF2 med peptiden. Ytterligare optimeringar krävs fortfarande. Tre konstruktioner av UBAP2L (N, C och L) designades och utsattes för reningsförsök. Fullängds-G3BP1 renades för att identifiera domäninteraktionen inom UBAP2L-konstruktionerna. Pull-down-testet med His-G3BP och samuttrycket av G3BP1/UBAP2L-N föreslog en mycket svag interaktion mellan G3BP1 och UBAP2L-N. Med tanke på de tillgängliga resultaten från vår studie och co-IP-tester från andra publicerade artiklar bör vi fokusera mer på studien av G3BP2, som föreslogs spela en mer direkt roll i att binda UBAP2L. / Ubiquitin Binding Protein 2-like (UBAP2L) and Ras GTPase-activating protein-binding protein 1 (G3BP1) are two core RNA-binding proteins (RBPs) involved in the assembly of SGs. Recent studies suggested that UBAP2L might serve as an upstream protein of G3BP1/2 with the ability to promote SG assembly independently. The NTF2 domain dimerizes G3BP1 and forms a platform for protein-protein interactions. Its interaction with the UBAP2L-DUF region was critical for mature SG formations. This project aimed to reveal the protein-protein interaction between G3BP1 and UBAP2L in vitro and characterize the known interaction between G3BP1-NTF2 and UBAP2L-DUF region. In this project, the G3BP1-NTF2 domain homodimer was purified and complexed UBAP2L-DUF derived peptide. Low diffraction crystal hits were obtained by co-crystallizing G3BP1-NTF2 with a synthesized peptide corresponding to residues 505 – 534 of UBAP2L (UBAP2L 505-534). While further optimizations are still required. Three constructs of UBAP2L (N, C, and L) were designed and subjected to purification trials.  Full-length G3BP1 was purified to identify the domain interaction within UBAP2L constructs. The his-G3BP pull-down assay and co-expression of G3BP1/UBAP2L-N suggested a very weak interaction between G3BP1 and UBAP2L-N. Considering the available results from our study and co-IP assays from other published papers, we should focus more on the study of G3BP2 which was suggested to play a more direct role in binding UBAP2L.