TRIM21 is a cytosolic ubiquitin ligase and an antibody receptor that providesa last line of defense against invading pathogens. By utilizing the diversity ofantibody repertoire to identify pathogens, TRIM21 serves as a link betweenintrinsic cellular defense and adaptive immunity. A variety of diseases havebeen linked to mutations of the TRIM family, including cancer, inflammatorydiseases, and autoimmune diseases. In this project, TRIM21 was producedand purified from Escherichia coli, (E.coli). Protein characterization wasperformed with SDS-PAGE, size exclusion chromatography and cryo-electronmicroscopy (cryo-EM). Previously TRIM21 has been shown to form a dimerwhen produced in SF9. Results from size exclusion chromatography show thatTRIM21 form a larger complex when expressed in E.coli. Cryo-EM resultsshow that the complex structure is more globular than previously thought.Purified TRIM21 was bound to the antibody IC100. SDS-PAGE and sizeexclusion chromatography results show much lower affinity to antibodies thanexpected. / TRIM21 är en cytosolisk ubiquitinligas- och antikroppsreceptor som ger ensista försvarslinje mot invaderande virus. Genom att använda mångfalden avantikroppsrepertoar för att identifiera patogener, fungerar TRIM21 som enlänk mellan inre cellulärt försvar och adaptiv immunitet. En mängd olikasjukdomar har kopplats till mutationer i TRIM-familjen, inklusive cancer,inflammatoriska sjukdomar och autoimmuna sjukdomar. I detta projekt produceradesoch renades TRIM21 från Escherichia coli, (E.coli). Proteinkarakteriseringutfördes med SDS-PAGE, gelfiltreringskromatografi och kryo-elektronmikroskopi(cryo-EM). Tidigare har TRIM21 visat sig bilda en dimer när den producerasi SF9. Resultat från gelfiltrering visar att TRIM21 bildar ett större komplexnär det uttrycks i E.coli. Cryo-EM-resultat visar att den komplexa strukturenär mer klotformig än man tidigare trott. Renad TRIM21 bands till antikroppenIC100. SDS-PAGE och gel-filtrerings resultat visar mycket lägre affinitet tillantikroppar än förväntat.

The ubiquitination process is vital to maintain the protein homeostasis in the cell. With high specificity it regulates degradation of proteins by tagging them with a small protein called ubiquitin. Four proteins are involved to perform the process and in this thesis one of these proteins is studied. This protein is called Ro52 and belongs to the TRIM protein family. It posses E3 ligase activity because of a N-terminal RING-domain and therefore it is responsible for the last step in the ubiquitination process. The structure of Ro52 is not totally solved and the function of the protein’s four domains is not fully understood. In this thesis three constructs of two domains from Ro52 (RING and B-box) is investigated by circular dichroism (CD), nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy and auto-ubiquitination assay by Western blot. The goal was to gain deeper insight in structural and functional properties of these domains. In the end only two constructs were investigated because of time limitations. It was shown by NMR that one construct has similar structure as the wild type but lower stability, possibly due to shorter N-terminal region. Comparison of the results from CD measurements showed that the constructs were well structured but did not reveal any significant differences in secondary structure between the constructs. Functional analysis by Western blot encountered unexpected problems and no results were obtained. The current thesis provides a basis for further investigation of variant constructs jointly expressing the RING-B-box domains, and shows that even small changes may alter structure and stability in ways that might affect functional properties.

In this work the involved mechanisms between Ro/SSA complex, composed also by the tripartite motif 21 (TRIM21alpha) and trove domain 2 (TROVE2) proteins, with respect to systemic lupus erythematosus (SLE) autoantibodies is studied. The work is divided in three chapters: I- In vitro and in silico analysis of the molecular recognition between lupus autoantibodies and TRIM21alpha Fc Receptor ; II- In vitro evidence of bipolar-bridged immune TROVE2 complexes in the pathogenesis of systemic lupus erythematosus and III- Label-free piezoelectric biosensor for prognosis and diagnosis of Systemic Lupus Erythematosus. Samples of lupic patients and health subjects were kindly provided by La Fe hospital, accordingly the required protocols. After its extraction and purification, the immunoglobulin samples were obtained to study in vitro protein interactions and the involved mechanism by using a quartz crystal microbalance with dissipation factor attributions, and dual polarization interferometry. Techniques such, polarization modulation infrared interferometry, x-ray photoelectron interferometry and contact angle measurement were used in order to characterize surfaces. Pre-steady-state analysis revealed an antibody bipolar bridging involved in both TRIM21alpha and TROVE2 proteins. Identification of the main immunodominant human linear epitope for TRIM21alpha was finely mapped using a series of overlapping synthetic polypeptides with a size of 21 amino acids. The epitopes recognised by autoantibodies for this protein spanned the linear sequence from the aminoacid 151 to 183, and a conformational epitope for SLE patients and healthy subjects, respectively. Autoantibodies from lupic patients targeted protein epitopes, allowing health subjects to be discriminated. Major Histocompatibility Complex Class-II binding peptide prediction results corroborated the sequence as the immunodominant linear epitope, mostly coded as the HLA DRB1*1304 allele for SLE patients, and HLA DRB1*0806 for controls. The subdominant epitope corresponded to the PRY-SPRY domain, recently known as mammalian Fc receptor. Finally, the TRIM21alpha protein structure was modeled by a new homology modeling, never before presented. From the TROVE2 protein, the major linear epitope recognized by autoantibodies correspond to the sequence from the aminoacid 160 to 210 for healthy subjects. However, the major epitope in SLE serum is undiscovered. We suggest that the difference between epitopes could correspond to a majority necrosis-induced specificity in SLE patients, and an apoptotic via in healthy subjects. TROVE2 showed the ability to bind to Fcs, depending on alkaline earth cations in solution. The results suggest that the TROVE2-TRIM21alpha binding is a calcium-dependent protein interaction linked through the MIDAS-like motif in the vWFA-like domain. Finally, a pratical consequence of all study was the development of label-free biosensing method, based in microbalance technology, for in vitro diagnostics of systemic lupus erythematosus patients, allowing the premature sensing of autoantibodies against TRIM21alpha and TROVE2 protein, in advance of the clinical illness symptoms appear. / En este trabajo se ha estudiado el mecanismo involucrado entre el complejo Ro/SSA, compuesto también por las proteínas tripartite motif 21 alpha(TRIM21alpha;) y trove domain 2 (TROVE2) con respecto a autoanticuerpos de pacientes que tienen lupus eritematoso sistémico, en comparación con autoanticuerpos de personas sanas. El estudio comprende tres capítulos: I- Análisis in vitro e in silico del reconocimiento molecular entre autoanticuerpos de lupus y receptor TRIM21alpha; Fc; II- Evidencias in vitro de complejos inmunes TROVE2 bipolares con puentes en la patogénesis del lupus eritematoso sistémico y III- Biosensor piezoeléctrico libre de marcaje para el pronóstico y el diagnóstico del lupus eritematoso sistémico. Las muestras de pacientes lúpicos y personas sanas fueron proporcionadas por el hospital La Fe de acuerdo con los protocolos establecidos. Tras una etapa de extracción y purificación de las inmunoglobulinas fueron estudiadas la interacción de proteínas in vitro utilizando una microbalanza de cristal de cuarzo con atribución de factor de disipación e interferometria de polarización dual. Técnicas de caracterización como espectroscopía infrarroja de reflexión-absorción por modulación de la polarización, espectroscopía fotoelectrónica de rayos-x y análisis de ángulo de contacto fueron utilizadas con la finalidad de caracterizar superficies. El análisis del estado pre estacionario ha revelado un mecanismo de puente bipolar para las dos proteínas, TRIM21alpha; y TROVE2. Tras su identificación, el epítopo linear inmunodominante fue mapeado para TRIM21alpha;, utilizando una serie de polipéptidos sintéticos superpuestos de 21 aminoácidos. Los epitopos reconocidos por autoanticuerpos para esta proteína abarca la secuencia lineal a partir del aminoácido 151 hasta el 183 para epitopos de pacientes lúpicos y sujetos sanos, respectivamente. Autoanticuerpos de pacientes lúpicos reconocieron epítopos de proteínas, permitiendo la discriminación de pacientes sanos. Los resultados de la unión del Complejo Mayor de Histocompatibilidad clase II con el péptido de unión corroboraron la secuencia cómo el epítopo lineal inmunodominante, codificado como el alelo HLA DRB1 * 1304 para pacientes con LES y HLA DRB1 * 0806 para los controles. El epitopo subdominante corresponde al dominio PRY-SPRY, recientemente conocido receptor Fc de mamífero. Finalmente, la estructura de la proteína TRIM21alpha; fue determinada utilizando un nuevo modelo de homología no presentado antes. De la proteína TROVE2, el epitopo lineal immunodominante reconocido por los autoanticuerpos corresponde a la secuencia que pudiera corresponder del aminoácido 160 hasta 210 para sujetos sanos. Sin embargo, el epitopo mayoritario en sueros lúpicos no fue determinado. Se sugiere que la diferencia entre los epitopos se corresponde mayoritariamente a una necrosis-inducida en pacientes lúpicos, y a una vía apoptótica en pacientes sanos. TROVE2 presentó la habilidad de unirse a Fcs dependiendo de los cationes alcalinos presentes en la disolución. Los resultados sugieren que la unión TROVE2-TRIM21alpha; es dependiente de la interacción con calcio vinculada a través del motivo MIDAS en el dominio vWFA. Finalmente, una consecuencia práctica de todo el estudio fue el desarrollo de un biosensor libre de marcaje para diagnóstico in vitro de lupus eritematoso sistémico, permitiendo la detección prematura de autoanticuerpos anti TRIM21alpha; y anti TROVE2, varios años antes de la aparición de los síntomas clínicos de la enfermedad. / En aquest treball s'ha estudiat el mecanisme involucrat en el complex Ro/SSA, compost per les proteïnes tripartite motif 21 (TRIM21alpha;) i trove domain 2 (TROVE2) respecte a autoanticossos de pacients que tenen lupus eritematós sistèmic, en comparació amb autoanticossos de persones sanes. L'estudi es divideix en tres capítols: : I- Anàlisi in vitro i in silico del reconeixement molecular entre autoanticossos de lupus i receptor TRIM21alpha; Fc; II- Evidències in vitro de complexos immunes TROVE2 bipolars amb ponts en la patogènesi del lupus eritematós sistèmic i III-Biosensor piezoelèctric lliure de marcatge per al pronòstic i el diagnòstic del lupus eritematós sistèmic. Les mostres de pacients lúpics y persones sanes van ser amablement proporcionades per l'hospital La Fe d'acord amb els protocols establerts. Després d'una etapa de purificació adequada, el pool de mostres de immunoglobulines va ser estudiat les interaccions in vitro de les proteïnes utilitzant una microbalança de cristall de quars amb atribució de factor de dissipació i interferometria de polarització dual. Tècniques de caracterització, como ara espectroscòpia de infraroja de reflexió-absorció per modulació de la polarització, espectroscòpia fotoelèctrica de rajos X i anàlisi d'angle de contacte van ser emprades amb per tal de caracteritzar les superfícies. L¿anàlisi de l`estat preestacionari ha revelat un mecanisme de pont bipolar que involucra les dos proteïnes, TRIM21alpha; i TROVE2. Una vegada identificat, va ser mapat l'epítop immunodominant lineal per a TRIM21alpha; emprant una sèrie de polipèptids sintètics superposats de 21 aminoàcids. Els epítops reconeguts per autoanticossos per a aquesta proteïna engloben la seqüència lineal a partir de l'aminoàcid 151 fins al 183 per a epítops de pacients lúpics y subjectes sans, respectivament. Autoanticossos de pacients lúpicos van reconèixer epítops de proteïnes, fet que va permetre la discriminació de pacients sans. Els resultats de la unió del Complexe Major de Histocompatibilitat classe II amb el pèptid de unió van corroborar la seqüència com l'epítop lineal immunodominant, codificat com l'al·lel HLA DRB1 * 1304 per a pacients amb LES i HLA DRB1 * 0806 per als controls. L'epítop subdominant correspon al domini PRY-SPRY, recentment conegut receptor Fc de mamífer. Finalment, l'estructura de la proteïna TRIM21alpha; va ser determinada utilitzant un nou model d'homologia no presentat abans. De la proteïna TROVE2, l'epítop lineal immunodominant reconegut pels autoanticossos correspon a la seqüència que pogués correspondre l'aminoàcid 160 fins al 210 per a subjectes sans. No obstant això, l'epítop majoritari en sèrums lúpics no va ser determinat. Es suggereix que la diferència entre els epítops es correspon majoritàriament a una necrosis induïda en pacients lúpics i a una via apoptòtica en pacients sans. TROVE2 va mostrar l'habilitat de unir-se a Fcs en funció dels cations alcalins presents en la dissolució. Els resultats suggereixen que la unió TROVE2-TRIM21alpha; depèn de la interacció amb calci vinculada a través del motiu MIDAS en el domini vWFA. Finalment, la conseqüència pràctica de tot l'estudi va ser el desenvolupament d'un biosensor sense marcatge per al diagnòstic in vitro de lupus eritematós sistèmic, el qual permet la detecció prematura d'autoanticossos cap a les proteïnes TRIM21alpha; i TROVE2 anys abans de l'aparició dels símptomes clínics de la malaltia. / Do Nascimento, NM. (2017). The Ro/SSA Complex in Systemic Lupus Erythematosus Patients [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/80534 / TESIS

Retinoblastoma-binding protein 4 (RBBP4) is a subunit of chromatin remodeling factor 1 (CAF-1) and is essential for mammalian oocyte maturation, embryo survival, and embryo implantation. RBBP4 also localizes to the chromatin and is a ubiquitously expressed nuclear protein. Previous methods used to study this protein include short interfacing RNAs (siRNAs) and CRISPR/Cas9. These techniques have limitations such as determining an indirect depletion of proteins, may trigger compensatory mechanisms, and may not be useful in non-dividing primary cells. A new, acute, and rapid endogenous protein depletion technique called Trim-Away, can overcome these limitations. Trim-Away is also widely applicable since it can be used with many off-the-shelf reagents. Trim-Away utilizes the TRIM21-antibody interaction within the cytosol and the ubiquitin-proteasome pathway (UPP) to target and degrade a protein of interest. Studying RBBP4 using Trim-Away can offer insight into possible new functions of RBBP4 and its maternal effect, and increase the knowledge on a new, acute, and endogenous protein depletion technique. Here we report that, RBBP4 is required for proper blastocyst development and RBBP4 is more abundant in MII oocytes than GVBD oocytes. We also report that the loss of RBBP4 hinders RNA synthesis and causes cell death in later stages of embryo development. While our Trim-Away methodology can deplete RBBP4 as early as the 2-cell stage in embryos, our oocyte Trim-Away protocol needs to be optimized.