p83 é uma proteína com massa molecular aparente de 83 kDa, supostamente ainda não descrita, específica de sistema nervoso, e desenvolvimento regulada. p83 interage fortemente com laminina, Tau, tubulina e heat shock protein 90. p83 foi inicialmente detectada por imunohistoquímica e western blot usando-se um anticorpo anti-lectina KM+ purificado por afinidade. Sua purificação a partir de cérebro de rato está em progresso. Identificar o envolvimento de p83 em processos do Sistema Nervoso Central humano é um passo necessário em direção à compreensão de sua função biológica. Uma biblioteca de expressão de cDNA de cerebelo de rato (Lambda ZAP II, Stratagene) foi submetida ao screening, usando-se um anticorpo específico para isolar o cDNA de p83. O anticorpo anti-KM+ foi pré-adsorvido contra proteínas de E. coli XL1 Blue MRF, antes de ser usado no screening. As membranas foram reveladas por imunodetecção cromogênica (fosfatase alcalina e NBT/BCIP). A análise de todos os clones Lambda ZAP II foi feita por excisão in vivo do fagomídeo pBluescript, subclonagem em E. coli XL1 Blue MRF, purificação do DNA plasmidial e digestão com Eco RI. A seqüência correspondente ao clone isolado foi analisada usando-se ferramentas e bancos de dados do NCBI. A seqüência nucleotídica mostrou identidade com as isoformas A e E de drebrina. As isoformas A e E de drebrina foram detectadas em adulto e embrião, respectivamente. Drebrina A é uma proteína sistema nervoso-específica, desenvolvimento regulada e associa-se com F-actina. Embora drebrina e p83 compartilhem propriedades em comum, nossos dados de western blot indicaram que parecem não se tratar da mesma proteína. Nós investigamos a expressão de drebrina em Displasia Cortical Focal tipo IIB, comparando com córtex normal. As secções de tecido foram coradas com hematoxilina-eosina e prata (Bielchowsky). Secções foram processadas por imunohistoquímica usando-se os anticorpos anti-drebrina M2F6 e o DAS2, e recuperação antigênica. A detecção foi feita usando-se um anticorpo biotinilado, e DAB como cromógeno. Os tecidos displásicos (13 casos) foram obtidos cirurgicamente de tecidos exibindo epilepsia droga-resistente. Os controles foram obtidos de necrópsia de 15 pacientes sem história prévia de doenças neurológicas ou alterações patológicas. Nossos resultados sugerem uma associação entre drebrina e DCF IIB, um distúrbio do desenvolvimento cortical. / p83 is 83 kDa protein supposedly not yet described, nervous system specific, and developmentally regulated. p83 strongly interacts with laminin, Tau, tubulin and heat shock protein 90. It was initially detected by immunohistochemistry and western blot using an affinity-purified anti-lectin KM+ antibody. Its purification from rat brain is in progress. Identifying the involvement of p83 in human Central Nervous System processes is a required step towards understanding its biological roles. A premade cDNA rat cerebellum expression library (Lambda ZAP II, Stratagene) has been screened, using a specific antibody to isolate p83 cDNA. Anti-KM+ antibody was pre-adsorbed against E. coli XL1 Blue MRF proteins, before using in screening. Membranes were revealed by cromogenic immunodetection (alcaline fostase and NBT/BCIP). The analysis of all positive Lambda ZAP II clones was carried out by in vivo excision of pBluescript, subcloning in E. coli XL1 Blue MRF, plasmidial DNA purification and Eco RI digestion. The sequence corresponding to the clone isolated was analyzed using the NCBI tools and database. The nucleotide sequence showed identity with drebrin A and E isoforms. Drebrin A and E isoforms were detected in adults and embryos. Drebrin A is a neuron-specific, development-regulated F-actin-binding protein. It participates in growth cone extension and dendritic spine formation. Although have same drebrin and p83 properties in common, they not seem to be the same protein. We have investigated the expression of drebrin in Focal Cortical Dysplasia type IIB (FCD IIB) as compared to normal cortex. Tissue sections were stained with hematoxylin-eosin and silver (Bielchowsky). Sections were processed for immunohistochemistry using anti-drebrin antibodies M2F6 and DAS2, and an antigen retrieval technique. Detection was carried out using a biotinylated antibody, using DAB as chromogen. Dysplastic tissues (13 cases) were obtained at surgery for drug-resistant epilepsy. Controls were obtained at autopsy from 15 patients without history of neurological disorder and gross pathological changes. A specific drebrin labeling in dysplastic tissue was more intense than in controls. Indeed, most control cases exhibited at most a slightly higher staining than the background. Balloon, clear and undetermined cells, and giant, dysmorphic neurons, showed a conspicuous labeling by anti-drebrin. These cells showed a thin rim labeling of the nuclear membrane, and a finely punctate nuclear labeling. In contrast, a coarse nuclear, but a faint cytoplasm labeling was observed in autopsy cases. Our data suggest an association between Drebrin expression and the FCD IIB, a disturbance of cortical development.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-13052010-153055 |
| Date | 01 June 2007 |
| Creators | Roberta de Assis Maia |
| Contributors | Antonio Roberto Martins, Jaderson Costa da Costa, Maria Luisa Paco Larson, André Luis Fernandes Palmini, Américo Ceiki Sakamoto |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Medicina (Neurologia), USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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