Para medicamentos administrados oralmente, as etapas de liberação do fármaco a partir da forma farmacêutica e sua subsequente absorção constituem importantes processos para que a adequada biodisponibilidade oral ocorra. Deste modo, as características de solubilidade e de permeabilidade são de extrema importância para que mecanismos relacionados à absorção sejam compreendidos no âmbito das propriedades ADME (absorção, distribuição, metabolismo e excreção). Com base nisso, o Sistema de Classificação Biofarmacêutica (SCB) foi proposto como uma ferramenta que permite a classificação de fármacos em quatro classes distintas de acordo com a solubilidade e permeabilidade. De maneira complementar, o Sistema de Classificação Biofarmacêutica de Distribuição de Fármacos (SCBDF) foi proposto levando em consideração a solubilidade e o metabolismo das substâncias, além de considerar o impacto de transportadores presentes nos tecidos biológicas, inclusive no trato gastrintestinal (TGI). Assim, o presente trabalho teve como objetivo avaliar os mecanismos envolvidos na permeabilidade de fármacos antirretrovirais (estavudina, lamivudina e zidovudina) por meio do modelo de perfusão in situ com coleta de sangue mesentérico em ratos, considerando os aspectos relacionados ao efluxo e ao metabolismo pré-sistêmico que ocorrem nos enterócitos. Além disso, estudos in vitro em culturas celulares MDCK e MDCK-MDR1 foram realizados a fim de auxiliar na elucidação dos mecanismos de transporte dos referidos fármacos. Para a realização dos estudos de perfusão in situ, ratos Wistar foram anestesiados e a porção do jejuno foi canulada para permitir a entrada do fármaco solubilizado no interior do intestino, bem como a coleta das amostras de perfusato em intervalos regulares de tempo. A veia mesentérica também foi canulada para viabilizar a obtenção das amostras de sangue durante os experimentos. Para os estudos de efluxo, o verapamil foi adicionado à solução de perfusão como inibidor de Pgp (glicoproteína-P), enquanto que o cetoconazol foi empregado como inibidor de enzimas CYP3A. Em modelo in vitro MDCK e MDCK-MDR1, os experimentos foram conduzidos bidirecionalmente com o uso de GG918 como inibidor de P-gp. Em todos os experimentos realizados, o metoprolol e a ranitidina foram empregados como marcadores de alta e de baixa permeabilidade, respectivamente. Os resultados de permeabilidade mostraram que a estavudina e a zidovudina apresentam características de alta permeabilidade, enquanto a lamivudina apresentou o menor resultado dentre os três fármacos. Os ensaios bidirecionais em MDCK, no entanto, mostraram que os três antirretrovirais apresentam baixos valores de permeabilidade, uma vez que seus resultados foram significativamente menores que o valor encontrado para o metoprolol. Com relação à avaliação do mecanismo de efluxo, tanto a lamivudina quanto a zidovudina apresentaram interações significativas com a P-gp nos dois métodos empregados (perfusão in situ e MDCK-MDR1), uma vez que o aumento nos valores de permeabilidade foi constatado quando o inibidor de P-gp foi empregado. Os estudos de metabolismo intestinal realizados por meio do modelo de perfusão in situ mostraram que nenhum dos fármacos antirretrovirais apresentou interação significativa com as enzimas CYP3A quando o cetoconazol foi empregado como inibidor, uma vez que não foram constatadas mudanças significativas nos valores de permeabilidade. A comparação entre os resultados de permeabilidade efetiva (Pef) e de permeabilidade aparente (Pap), obtidos por meio da quantificação das amostras de perfusato e de plasma, respectivamente, permitiu verificar que as diferenças estatísticas entre estes dois parâmetros podem indicar variados mecanismos de transporte, uma vez que a Pap constata a quantidade da substância que realmente foi capaz de superar as barreiras físicas e bioquímicas presentes na parede do TGI. Logo, a Pap é considerada um parâmetro mais próximo das condições in vivo. Esta diferença foi constatada apenas para a zidovudina nos ensaios de transporte de efluxo, uma vez que o valor médio de Pef não representou a mesma conclusão fornecida pelo valor médio de Pap. Os resultados obtidos permitiram concluir que os fármacos antirretrovirais apresentam permeabilidade de moderada a alta em função do possível envolvimento de carreadores de influxo. Além disso, os três fármacos antirretrovirais interagiram de alguma forma com a P-gp, sendo os resultados referentes à lamivudina e à zidovudina mais significativos. Embora tenha sido constatada o envolvimento da P-gp na permeabilidade da zidovudina, sua elevada fração absorvida indica que a absorção desta substância não é limitada por este mecanismo e que a ação do carreador de efluxo não é clinicamente relevante neste caso. Com relação aos estudos de metabolismo, a presença de enzimas CYP3A nos enterócitos também não representou uma condição desfavorável para a absorção dos antirretrovirais. Assim, a avaliação dos mecanismos no presente trabalho contribuiu para a caracterização biofarmacêutica da estavudina, lamivudina e zidovudina e as metodologias descritas podem ser empregadas nas etapas iniciais de desenvolvimento farmacêutico com o objetivo de assegurar a segurança e a eficácia de medicamentos. / For orally administered pharmaceutical products, the drug release from the dosage form and its absorption are considered important processes for adequate oral bioavailability. Thus, the solubility and permeability characteristics are extremely important for understanding of mechanisms related to the absorption in the scope of the ADME properties (absorption, distribution, metabolism and excretion). Based on that, the Biopharmaceutics Classification System (BCS) was proposed as a tool for classifying drugs into four classes considering their solubility and permeability characteristics. In an additional way, the Biopharmaceutics Drug Disposition Classification System (BDDCS) was proposed considering the solubility and metabolism of compounds. Besides, the BDDCS also considers the impact of transporters in biological tissues, such as in the gastrointestinal tract (GIT). Thus, this study aimed to evaluate the mechanisms involved in the permeability of antiretroviral drugs (stavudine, lamivudine and zidovudine) using the intestinal in situ perfusion model with mesenteric blood sampling in rats, considering efflux and intestinal pre-systemic metabolism that occur in the enterocytes. Furthermore, in vitro studies in cell cultures MDCK and MDCK-MDR1 were performed in order to elucidate the transport mechanisms of the drugs. For intestinal in situ perfusion studies, Wistar rats were anesthetized and a portion of jejunum was cannulated to allow the drug entry into the intestine, as well as the perfusate sampling at regular time intervals. The mesenteric vein was also cannulated to allow blood sampling during the experiments. For efflux studies, verapamil was used as P-gp (P-glycoprotein) inhibitor while ketoconazole was used as CYP3A inhibitor. In in vitro model MDCK and MDCK-MDR1, the experiments were performed bidirectionally using GG918 as P-gp inhibitor. For all experiments, metoprolol and ranitidine were used as markers of high and low permeability, respectively. Permeability results showed that stavudine and zidovudine present high permeability characteristics while lamivudine showed the lowest value. However, bidirectional studies in MDCK showed that the antiretroviral drugs present low permeability since their results are far from metoprolol\'s results. Regarding efflux studies, both lamivudine and zidovudine presented relevant interaction with P-gp in in situ perfusion and MDCK-MDR1 models, since the increase in permeability values was observed when P-gp inhibitor was added. Metabolism studies performed through intestinal in situ perfusion showed that none of antiretroviral drugs interact significantly with CYP3A enzymes, since that no variation in permeability results were noticed. Comparison between effective permeability (Peff) and apparent permeability (Papp), obtained from prefusate and plasma, respectively, allowed to check that statistical differences between these two parameters can indicate different transport mechanisms, since Papp is related to the drug amount that really overcome the physical and biochemical barriers in the gut. Thus, Papp is considered the closest parameter to in vivo condition. This difference was observed for zidovudine in efflux studies, since Peff values does not match with the conclusion provided by the Papp. The results obtained allowed to conclude that the antiretroviral drugs presents moderate to high permeability due to the involvement of influx carriers. Furthermore, the antiretroviral drugs interacted with the P-gp, but lamivudine and zidovudine showed significant results. Although the involvement between zidovudine and P-gp is observed, its high fraction absorbed indicates that the absorption is not limited by efflux transporter, which is not relevant clinically. Regarding 32 metabolism studies, CYP3A enzymes is not considered as a limiting condition for absorption of the antiretroviral drugs. Thus, the evaluation of the mechanisms contributes for biopharmaceutical characterization of stavudine, lamivudine and zidovudine and the methodologies used in this study can be applied in early drug development to ensure adequate safety and efficacy of pharmaceutical products.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-11082017-100954 |
| Date | 10 August 2017 |
| Creators | Thaisa Marinho Dezani |
| Contributors | Cristina Helena dos Reis Serra, Samanta Cardozo Mourão, Hérida Regina Nunes Salgado, Jacqueline de Souza |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Fármaco e Medicamentos, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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