O conhecimento do genoma humano e os avanços na biologia molecular levaram a descoberta de mecanismos celulares importantes. A terapia gênica surgiu com a proposta de interferir na fisiologia das células, que apresentam alguma disfunção causadora de uma doença, trazendo a possibilidade de tratamento para incontáveis enfermidades. Na tecnologia de RNA de interferência pequenos fragmentos de RNA de fita dupla (small interference RNA, siRNA) são utilizados para inibir a expressão de genes específicos. O olho tem sido um dos órgãos alvo para o uso desse tipo de tecnologia e, além disso, a córnea é uma membrana atrativa devido ao fácil acesso e a existência de diversas enfermidades que acometem a visão. Para aumentar a biodisponibilidade e viabilizar a administração de siRNA utilizando um polímero catiônico, uma formulação termorreversível com quitosana e outra composta de cristais líquidos funcionalizados com ácido hialurônico foram estudadas como possíveis sistemas de liberação ocular de siRNA, sendo que ambas são inéditas para aplicação tópica e oftálmica de siRNA. O gel termorreversível de poloxamer 407 foi associado a dois diferentes tipos de quitosana (LMW com 92,2% de desacetilação e MMW com 77,0% de desacetilação). Ambas as formulações apresentaram características desejáveis tanto como sistema de liberação de genes, tanto por apresentarem residual positivo e capacidade de complexar o siRNA, quanto como sistema compatível com via tópica ocular, devido ao comportamento reológico pseudoplástico. A quitosana LMW e a adição de NaCl à formulação alteraram a Tsol/gel do poloxamer; somente a associação com a quitosana MMW apresentou Tsol/gel adequada. Os sistemas contendo poloxamer em associação com os dois diferentes tipos de quitosana não promoveram a penetração do siRNA in vitro em córnea bovina nas condições experimentais utilizadas. O sistema líquido cristalino foi desenvolvido com monoleína (MO), polietilenimina (PEI), ácido hialurônico (HA) e fase aquosa. A formação de fases cristalinas foi avaliada por microscopia de luz polarizada e a estrutura das mesofases foi confirmada pela difração de raios X a baixo ângulo. O sistema líquido cristalino, composto de uma mistura de cristais de fase cúbica e hexagonal, foi disperso em nanopartículas de tamanho satisfatório, de aproximadamente 166 nm. Os sistemas apresentaram características desejáveis como sistema de liberação de genes, como potencial zeta adequado, capacidade de complexar sem degradar o siRNA e não foram citotóxicos em fibroblastos L929, além de serem compatíveis com a via ocular por serem isotônicos. A dispersão de cristais de MO/PEI foi capaz de transfectar as células L929, entretanto a incorporação do HA diminuiu a absorção celular, provavelmente devido ao elevado peso molecular do ácido hialurônico empregado. O presente estudo permite delinear o futuro desenvolvimento de formulações tópicas para administração de siRNA na córnea. / The understanding of human genome and the evolvement of molecular biology led to discovery of important cellular mechanisms. Gene therapy has emerged as an approach to interfere with cell physiology, whenever it has a dysfunction that causes a disease, bringing new possibility of treatment to countless illnesses. In RNA interference mechanism, small double-stranded RNAs (small interference RNA, siRNA) inhibit specific gene expression. The eye has been one of the targeted organs for the use of such technology and, moreover, the corneal membrane is an attractive tissue due to the easy access and the existence of several diseases that can impair vision. To enhance bioavailability and facilitate the delivery of siRNA using a cationic polymer, a thermoreversible formulation containing chitosan and a liquid crystalline formulation functionalized hyaluronic acid were studied as potential delivery systems for ocular delivery of siRNA and both this systems are inedited as topical and ocular delivery of siRNA. A poloxamer 407 thermoreversible gel of was associated with two different types of chitosan (LMW with 92.2% deacetylation and MMW with 77.0% deacetylation). Both formulations showed desirable characteristics not only as gene delivery systems due to positive residual charge and capacity for complexing the siRNA, but also as a compatible ocular delivery system, due to pseudoplastic rheological behavior. The LMW chitosan and addition of NaCl to the formulation influenced the Tsol/gel of poloxamer gel; only the association with MMW chitosan showed desirable Tsol/gel. The systems containing poloxamer in combination with two different types of chitosan did not promote in vitro penetration of siRNA using bovine cornea under the used experimental conditions. The liquid crystalline system was developed with monoolein (MO), polyethylenimine (PEI), hyaluronic acid (HA) and aqueous phase. The formation of crystalline phases was observed by polarized light microscopy and the mesophases structures were confirmed by small angle X-ray diffraction. The liquid crystalline system composed of a mixture of hexagonal and cubic phases was dispersed into nanoparticles of suitable size, of approximately 166 nm. The formulations showed desirable characteristics as gene delivery systems, such as suitable zeta potential, ability to complex without degrading the siRNA and were not cytotoxic to fibroblasts L929, moreover, were compatible with the ocular administration due to isotonicity. The dispersion of crystals of MO/PEI was able to transfect L929 cells, however the incorporation of the HA decreased cellular uptake, probably due to high molecular weight hyaluronic acid employed. This study provides an outline for the future development of topical formulations to deliver siRNA to the cornea.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:teses.usp.br:tde-11012013-103324 |
| Date | 10 October 2012 |
| Creators | Thais Fedatto Abelha |
| Contributors | Maria Vitoria Lopes Badra Bentley, Priscyla Daniely Marcato Gaspari, Maria Palmira Daflon Gremião |
| Publisher | Universidade de São Paulo, Ciências Farmacêuticas, USP, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | Portuguese |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da USP, instname:Universidade de São Paulo, instacron:USP |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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