Der Ersatz von geschädigtem Gewebe durch körpereigene Reparaturprozesse wird auf zellulärer Ebene durch Stammzellen unterstützt. Diese Regenerationsfähigkeit ist allerdings in einigen Geweben nur eingeschränkt vorhanden. So kommt es bei der Sehnenheilung des Pferdes unter konventioneller Therapie zur narbigen Reparation mit hohen Rezidivraten. Die Anwendung von multipotenten mesenchymalen Stromazellen (MSC) stellt eine innovative Therapiemethode dar, da die tenogene Differenzierung zum Zellersatz mit anschließender Matrixmodulation führen könnte. Es ist jedoch unklar, ob eine entzündliche Umgebung in diesem Zusammenhang Einfluss auf funktionelle Eigenschaften der MSC hat.
In dieser Arbeit wurden erstmalig funktionelle Eigenschaften, mit dem Fokus des tenogenen Differenzierungspotentials, von aus Fettgewebe isolierten equinen MSC, unter dem Einfluss proinflammatorischer Zytokine und einer direkten Leukozyten-Ko-Kultur, untersucht. Es wurde ein komplexes In-vitro-Modell entwickelt, um die in vivo vorherrschenden Bedingungen bestmöglich zu berücksichtigen.
Es konnte erstmals nachgewiesen werden, dass funktionelle und tenogene Eigenschaften von MSC in einem komplexen In-vitro-Modell unter dem Einfluss von proinflammatorischen Zytokinen oder Leukozyten beeinträchtigt werden. Dies hebt die Notwendigkeit zur Untersuchung der komplexen Zusammenhänge während einer akuten Entzündungsreaktion hervor. Es bleibt zu klären, ob trotz der starken Beeinflussung der tenogenen Eigenschaften der vorherrschende Mechanismus der Stammzell-unterstützten Sehnenheilung die tenogene Differenzierung der MSC sein kann.:Inhaltsverzeichnis
1 Einleitung
2 Literaturübersicht
2.1 Multipotente mesenchymale Stromazellen
2.1.1 Eigenschaften
2.1.2 Quellen und Charakterisierung
2.1.3 Therapeutisches Potential
2.2 Pathologie der equinen oberflächlichen Beugesehne
2.2.1 Tiermodell Pferd
2.2.2 Erkrankungen der equinen oberflächlichen Beugesehne
2.2.3 Die Bedeutung der Entzündungsreaktion
2.2.4 Die Bedeutung proinflammatorischer Zytokine und Leukozyten
2.3 Therapeutische Möglichkeiten zur Behandlung von Sehnenpathologien
2.4 Sehnen-Tissue Engineering
2.5 Induktion der tenogenen Differenzierung von MSC
2.6 Bioreaktorsysteme im Sehnen-Tissue Engineering
3 Zielstellung und Hypothesen
4 Tiere, Material und Methoden
4.1 Mesenchymale Stromazellen
4.1.1 Tiere
4.1.2 Material
4.1.3 Methoden
4.1.3.1 Auftauen von AT-MSC
4.1.3.2 Kultivierung von AT-MSC
4.1.3.3 Passagieren von AT-MSC
4.2 Equine oberflächliche Beugesehnen
4.2.1 Material
4.2.2 Methoden
4.2.2.1 Gewinnung von equinen OBS
4.2.2.2 Dezellularisierung von equinen OBS
4.2.2.3 Zuschnitt zu Sehnenscaffolds
4.3 Leukozyten
4.3.1 Spendertier
4.3.2 Material
4.3.3 Methoden
4.3.3.1 Blutentnahme
4.3.3.2 Leukozytenisolierung durch Dichtegradientenzentrifugation
4.3.3.3 Leukozytenstimulation
4.4 Versuchsaufbau
4.5 Aussaat von Scaffold- und Monolayerkulturen
4.5.1 Material
4.5.2 Methoden
4.5.2.1 Monolayerkulturen
4.5.2.2 Scaffoldkulturen
4.6 Bioreaktor
4.7 Stimulation und Stimulationsmuster
4.8 Zugabe von Zytokinen
4.9 Auswertung
4.10 Phasenkontrastmikroskopie und Zellzahlbestimmung
4.10.1 Material
4.10.2 Methoden
4.10.2.1 Automatisierte Auswerung von Aufnahmen der
Phasenkontrastmikroskopie
4.10.2.2 Zellzahlbestimmung
4.11 Lebend/Tot-Färbung
4.11.1 Material
4.11.2 Methoden
4.11.2.1 Lebend/Tot-Färbung der Monolayerkulturen
4.11.2.2 Lebend/Tot-Färbung der Scaffoldkulturen
4.11.2.3 Auswertung
4.12 Histologie
4.12.1 Material
4.12.2 Methoden
4.12.2.1 Fixierung und Paraffineinbettung
4.12.2.2 Mikrotomschnitte
4.12.2.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung
4.12.2.4 Auswertung
4.13 Real-Time PCR
4.13.1 Material
4.13.2 Methoden
4.13.2.1 RNA-Isolierung aus Scaffoldkulturen
4.13.2.2 Zellaufschluss der Monolayerkulturen
4.13.2.3 cDNA-Synthese durch Reverse Transkription
4.13.2.4 Real-Time PCR
4.14 Tripotente Differenzierung
4.14.1 Material
4.14.2 Methoden
4.14.2.1 Zellaussaat, Kultivierung und Fixierung
4.14.2.2 Färbung der adipogenen Differenzierung
4.14.2.3 Färbung der osteogenen Differenzierung
4.14.2.4 Färbung der chondrogenen Differenzierung
4.14.2.5 Automatische Auswertung
4.15 Statistische Auswertung
5 Ergebnisse
5.1 Morphologie, Proliferation und Konfluenz der MSC
5.2 Lebend/Tot-Färbung
5.3 Hämatoxylin-Eosin-Färbung
5.4 Genexpression der muskuloskelettalen Marker
5.4.1 Monolayerkultur
5.4.2 Unstimulierte Scaffoldkultur
5.4.3 Stimulierte Scaffoldkultur
5.4.4 Vergleichende Analyse der Versuchsreihen
5.5 Tripotente Differenzierung
5.5.1 Adipogene Differenzierung
5.5.2 Chondrogene Differenzierung
5.5.3 Osteogene Differenzierung
6 Diskussion
6.1 Diskussion der verwendeten Methoden
6.2 Diskussion der Ergebnisse
6.3 Schlussfolgerung
7 Zusammenfassung
8 Summary
9 Literaturverzeichnis
10 Anhang
10.1 Herstellung von Reagenzien
10.2 RNA-Isolierung mittels RNeasy Mini Kit®
10.3 Färbeprotokolle
10.4 Herstellung von Silikonschalen
10.5 Extreme Ausreißerwerte der Genexpressionsanalysen
10.5.1 Monolayerkultur
10.5.2 Unstimulierte Scaffoldkultur
10.5.3 Stimulierte Scaffoldkultur
Danksagung
| Identifer | oai:union.ndltd.org:DRESDEN/oai:qucosa:de:qucosa:71394 |
| Date | 03 July 2020 |
| Creators | Brandt, Luisa |
| Contributors | Universität Leipzig |
| Source Sets | Hochschulschriftenserver (HSSS) der SLUB Dresden |
| Language | German |
| Detected Language | German |
| Type | info:eu-repo/semantics/acceptedVersion, doc-type:doctoralThesis, info:eu-repo/semantics/doctoralThesis, doc-type:Text |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
| Relation | 10.3390/ijms19092549 |
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