Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / A ConBr à uma proteÃna tetramÃrica presente em sementes de Canavalia brasiliensis e que possui afinidade para os aÃÃcares D-mannose e D-glucose. à vasto o uso desta lectina em ensaios biotecnolÃgicos devido as suas propriedades biolÃgicas. à comumente utilizada conjugada ao FITC, um fluorÃforo amplamente utilizado nas diversas Ãreas da biotecnologia para anexar um marcador fluorescente a proteÃnas atravÃs do grupamento amina. No entanto, a influÃncia deste fluorÃforo na atividade de tais proteÃnas precisa ser mais bem evidenciada. Essa pesquisa visou obter informaÃÃes sobre as alteraÃÃes na estrutura secundÃria da proteÃna ConBr nativa e conjugada com FITC, alÃm de iniciar um estudo desta lectina tambÃm conjugada com pontos quÃnticos. Amostras de ConBr nativa, conjugada com o FITC (ConBr-FITC (2%)), misturada com FITC na proporÃÃo de 2% em massa (ConBr/FITC (2%)), misturada com FITC na proporÃÃo de 20% em massa (ConBr/FITC (20%)) e processada mas nÃo conjugada com o FITC (ConBr-), foram analisadas por espectroscopia de infravermelho com transformada de Fourier (FTIR) atravÃs da tÃcnica de reflectÃncia total atenuada (ATR). Foram realizados testes de atividade hemaglutinante especÃfica com ConBr nativa, ConBr-FITC (2%), ConBr/FITC (2%), ConBr- e ConBr conjugada com pontos quÃnticos (ConBr-QD Zn/Cd). A atividade hemaglutinante especÃfica nos extratos foi determinada usando-se suspensÃes de hemÃcias de coelho a 3% em placas de microtitulaÃÃo. Os dados obtidos nos ensaios de atividade especÃfica foram submetidos ao teste estatÃstico de Mann-Whitney. Quando os espectros de ConBr nativa e ConBr-FITC (2%) foram comparados, observou-se que o pico da lectina nativa referente Ãs estruturas de folhas β, nÃo sofreu qualquer modificaÃÃo quando a proteÃna foi conjugada com FITC, entreteanto, notou-se uma diminuiÃÃo da intensidade na regiÃo do espectro referente Ãs estruturas em α-hÃlice, o que permite inferir uma reduÃÃo da quantidade destas estruturas. Houve tambÃm um aumento de intensidade na regiÃo referente Ãs estruturas irregulares. Os espectros de ConBr nativa, ConBr- e ConBr/FITC (2%) nÃo sugeriram alteraÃÃes na estrutura secundÃria. Nos testes de atividade hemaglutinante especÃfica de ConBr nativa e ConBr-FITC (2%) houve uma diminuiÃÃo da atividade especÃfica para esta Ãltima em relaÃÃo a primeira e estes resultados demonstraram diferenÃa estatisticamente significativa entre si. ConBr nativa e ConBr- nÃo apresentaram diferenÃas estatÃsticas significativas entre si. A atividade de ConBr/FITC
(2%) tambÃm nÃo apresentou diferenÃas estatÃsticas em relaÃÃo à ConBr nativa. Em conjunto, estes resultados contribuem e reforÃam a proposiÃÃo de que à a ligaÃÃo do FITC à proteÃna que promove a alteraÃÃo estrutural na regiÃo de α-hÃlice. A atividade especÃfica de ConBr-QD Zn/Cd diminuiu drasticamente quando comparada com a atividade de ConBr nativa, apresentando diferenÃa estatisticamente significativa entre estas amostras. AnÃlises estatÃsticas realizadas com os dados obtidos no teste de atividade especÃfica e anÃlise dos espectros de infravermelho sugerem alteraÃÃes na estrutura secundÃria da lectina ConBr conjugada ao FITC. PorÃm, ainda à necessÃria a elucidaÃÃo da natureza dessa alteraÃÃo e se essa à realmente devida à ligaÃÃo da proteÃna ao fluorÃforo. / ConBr is a tetrameric protein found in Canavalia brasiliensis seeds and has affinity for D-mannose and D-glucose carbohydrates. It is vast use of this lectin in biotechnological assays due their biological properties, and itâs used commonly linked to FITC, a fluorophore widely used in various fields of biotechnology to attach to proteins a fluorescent marker through amine grouping. However, the fluorophore influence in proteins activity must be further highlighted. This research aimed obtain informations about native ConBr secondary structure and FITC-conjugated changes and start a study of this lectin conjugated quantum dots also. Samples of native ConBr, ConBr-FITC conjugated (FITC-ConBr (2%)), ConBr mixed with the FITC proportion of 2% by mass (ConBr/FITC (2%)), ConBr mixed with FITC at 20 mass% (ConBr/FITC (20%)) and processed but not conjugated with FITC ConBr (ConBr-) were analyzed by Fourier Transform Infrared spectroscopy (FTIR), mode ATR (Attenuated Total Refectance). The native ConBr, ConBr-FITC (2%), ConBr/FITC (2%), ConBr-, and conjugated quantum dots ConBr (QD ConBr-Zn / Cd) specific haemagglutinating activity were performed. The specific haemagglutinating activity in the extracts was determined using the rabbit erythrocytes suspensions at 3% in microtiter plates. The specific activity data were tested using the Mann-Whitney test. When the native ConBr and FITC-ConBr (2%) spectra were compared, it was found the peak of the native lectin relating to β-sheet structures not suffered modification when the protein was conjugated with FITC, but there was a intensity reduction in the spectrum region relating to α-helix structures, which allows a reduction in the amount these structures. There was an intensity increase of irregular structures also. Native ConBr, ConBr- e ConBr/FITC (2%) spectra suggested no changes in secondary structure. There was a ConBr-FITC (2%) hemagglutinating activity decrease and that result showed statistically significant difference to native ConBr. Native ConBr and ConBr- do not have significantly differences. The ConBr/FITC (2%) activity didnât showed statistical differences regarding native ConBr. These results contribute and reinforce the proposition that is the FITC binding to protein promotes the structural change in the α-helix region. The ConBr-QD Zn/Cd specific activity decreased compared with the activity of native ConBr, demonstrating statistically significant differences between these samples. Statistical analyzes using the data obtained in the specific activity test and infrared
spectra analysis suggest lectin ConBr FITC-conjugated secondary structure changes. However, itâs still necessary elucidate the nature of this change, and whether this is really due to the protein-fluorophore binding.
| Identifer | oai:union.ndltd.org:IBICT/oai:www.teses.ufc.br:6692 |
| Date | 26 April 2013 |
| Creators | Aline de Carvalho Oliveira |
| Contributors | Ricardo Pires dos Santos, JoÃo Batista Cajazeiras, Emmanuel Silva de Marinho |
| Publisher | Universidade Federal do CearÃ, Programa de PÃs-GraduaÃÃo em Biotecnologia (Campus da UFC em Sobral-CE), UFC, BR |
| Source Sets | IBICT Brazilian ETDs |
| Language | Portuguese |
| Detected Language | English |
| Type | info:eu-repo/semantics/publishedVersion, info:eu-repo/semantics/masterThesis |
| Format | application/pdf |
| Source | reponame:Biblioteca Digital de Teses e Dissertações da UFC, instname:Universidade Federal do Ceará, instacron:UFC |
| Rights | info:eu-repo/semantics/openAccess |
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